[发明专利]马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的制备方法。

背景技术

马铃薯纺锤块茎类病毒病是威胁我国马铃薯生产的检疫性病害，但该病害在我国却普遍存在，因此，准确的检验技术和方法对于防治马铃薯纺锤块茎类病毒病至关重要。然而，无论采用哪种技术，都必须有标准物质，即阴性对照和阳性对照，没有这些标准物质，检测工作就无法进行。然而目前马铃薯纺锤块茎类病毒的标准物质主要采用繁殖阳性或阴性植株的方式来获得，这种方式进行活体保存非常不方便，需要不断的繁殖，费时、费力。

发明内容

本发明是要解决现有马铃薯纺锤块茎类病毒的标准物质的保存非常不方便，需要不断的繁殖，费时、费力的问题，提供马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的制备方法。

本发明马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的制备方法，按以下步骤进行：一、采用常规的马铃薯纺锤块茎类病毒检验方法对马铃薯植物组织进行检验，将感染了马铃薯纺锤块茎类病毒的马铃薯植物组织作为阳性组织，将没有感染马铃薯纺锤块茎类病毒的马铃薯植物组织作为阴性组织；二、将阳性组织在常温下自然干燥至恒重，之后进行粉碎至80目，得到阳性标准物质；将阴性组织在常温下自然干燥至恒重，之后进行粉碎至80目，得到阴性标准物质；将阳性标准物质和阴性标准物质进行密封，于室温、干燥条件下保存，即完成马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的制备。

步骤一所述常规的马铃薯纺锤块茎类病毒检测方法为：聚丙烯酰胺往返电泳(R-PAGE)、核酸斑点杂交(NASH)或RT-PCR。

本发明的马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质在使用时所取用量为待检新鲜样品所取质量的1/5～1/2，其他使用方法与待检新鲜样品相同。

本发明创造以非常简洁的方式研制出了马铃薯纺锤块茎类病毒的标准物质，该标准物质制作简单，保存和使用都很方便，对于防治马铃薯纺锤块茎类病毒必不可少。本发明制备的标准物质保存容易，保存时间长，在室温、干燥条件下保存1年后仍可以使用。

常规的马铃薯类病毒标准物质的制备一般采用组织培养继代或种植保存法，这些方法消耗大量的人力、物力、财力和空间，而且，一旦操作不当，隔离控制不严格还容易是病原外流，传染健康的马铃薯，对生产造成威胁。

本发明的制备过程极为简单，无需高端设备，使用方便，准确性好，保存和运输方便，填补了我国没有马铃薯纺锤块茎类病毒标准物质的空白。

附图说明

图1为传统标准物质与具体实施方式一制备的标准物质进行核酸斑点杂交的检测结果；图2为传统标准物质与具体实施方式一制备的标准物质进行聚丙烯酰胺往返电泳的检测结果。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的制备方法，按以下步骤进行：一、采用常规的马铃薯纺锤块茎类病毒检验方法对马铃薯植物组织进行检验，将感染了马铃薯纺锤块茎类病毒的马铃薯植物组织作为阳性组织，将没有感染马铃薯纺锤块茎类病毒的马铃薯植物组织作为阴性组织；二、将阳性组织在常温下自然干燥至恒重，之后进行粉碎至80目，得到阳性标准物质；将阴性组织在常温下自然干燥至恒重，之后进行粉碎至80目，得到阴性标准物质；将阳性标准物质和阴性标准物质进行密封，于室温、干燥条件下保存，即完成马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的制备。

为验证马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质的使用效果，进行以下实验：

(一)核酸斑点杂交

1、类病毒样品RNA的提取

取0.2g传统马铃薯纺锤块茎类病毒检测标准物质(即感染纺锤块茎类病毒的马铃薯)和0.04g～0.1g本实施方式制备的标准物质，分别进行以下操作：放于研样袋中，加入0.3mL提取缓冲液，磨碎，转入1.5mL离心管中，37℃孵育15min，加入等体积的氯仿(0.3mL)，振荡离心管，直至出现乳状液，短暂离心至溶液分离，吸出上清液即为RNA样品，4℃保存，备用。

2、点样及固定

吸取2μL受检样品RNA提取液，点在尼龙膜的方块格中，将点样后的膜放在紫外交联仪上正反面各交联1min，能量为1200。

3、杂交

取5mL的杂交液，加入1μL探针，混匀，将固定好的膜放入杂交管中，排除气泡，68℃，8～15rpm杂交过夜。

4、洗膜

a.用镊子取出膜，放入装有20mL 2×SSC，0.1％SDS溶液的平皿中，在室温下振荡洗涤2次，每次5min。