[发明专利]一种病毒释放缓冲液的制备及其应用

说明书

技术领域

本发明属于兽用疫苗领域，具体地，涉及一种病毒释放缓冲液及用该病毒释放缓冲液提高胚液病毒滴度和制备多联苗的方法。

背景技术

禽类疫苗主要通过鸡胚繁殖病毒而生产。该种疫苗具有制备工艺简单，免疫效果确实，免疫持续时间较长等特点，已被许多国家地区在家禽中使用，并在预防和控制禽流感暴发中起到一定积极作用。但灭活疫苗存在免疫效率低下，免疫剂量较大，监测中难于区分疫病的疫苗免疫与野度感染，并且还存在散毒的危险等缺点。另外，采用传统的灭活疫苗对禽流感进行预防，往往由于新的禽流感变异株的出现而导致免疫失败。尽管如此，用疫苗预防仍是禽病防治的主要措施和关键环节，在许多国家禽病防治中都起到了极其重要的作用。在规模化生产禽流感油乳剂灭活苗中，通过对原辅材料、生产过程关键技术地控制和工艺改进等措施，生产出高效、稳定的产品。生产过程的关键技术直接关系到产品的质量，是生产高效优质产品的保障。

目前，有许多研究致力于从胚液中纯化病毒或者生产相应产品。有人通过乙醚等化学试剂从浓缩的胚液中提取病毒提高病毒产量。提取病毒的目的在于，病毒颗粒与细胞碎片或者块状物质分离开。有人通过离子交换层析分离病毒；也有人通过，通过中等速度离心去除胚液中的大块物质，然后通过CaHPO4凝胶吸附澄清胚液中的病毒颗粒，达到纯化病毒的目的。也有通过低速离心去除胚液中的大块物质，然后通过高速离心回收病毒并且溶于磷酸盐缓冲液中保存。也有人发现如果在感染病毒的细胞或者胚液中加入高浓度的盐溶液，最终能够提高病毒的产量和纯度。有人研究发现，流感病毒液中加入0.3MNaCl降低纯化后的流感病毒聚集。虽然有不少人对采用了不同方法对禽流感病毒进行了分离纯化，但是这些方法明显存在以下缺点：处理量小，例如高速离心；价格贵例如采用离子交换层析；对病毒抗原纯在影响，例如使用乙醚等化学试剂从浓缩的胚液中提取病毒。这些因素均不利于产业化。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术不足之处，提供一种病毒释放缓冲液及用该病毒释放缓冲液提高胚液病毒滴度和制备多联苗的方法，该方法能够提高胚液禽类病毒的检测病毒滴度，处理病毒后能够提高病毒颗粒的稳定性，对病毒抗原没什么影响，且可大量处理胚液病毒，处理速度快。

本发明是通过下述技术方案实现的：一种病毒释放缓冲液，所含组分及各组分的质量含量如下：

氯化钠(NaCl)：7-25g；

氯化钾(KCl)：0.00-5.0g；

氯化镁(MgCl2)：0.5-2.5g；

磷酸氢二钠(Na2HPO4)：0.1-3.0g；

乙二胺四乙酸(EDTA)：0.15-1.5g；

甘氨酸：1-6.0g；

谷氨酰胺：1-5.0g；

组氨酸：0.5-2.0g；

丝氨酸：1-10g；

赖氨酸：1-10g；

精氨酸：5-8g；

吐温-80：0.5-2.0g；

曲拉通X-100：0.1-20g；

甘油：2-18g；

按配方称量以上试剂，全部溶解于蒸馏水中，调整pH为7.0-7.5，最终溶液体积定容为1L，即得所述病毒释放缓冲液。

用所述病毒释放缓冲液提高胚液病毒滴度的方法，包括如下具体步骤：

步骤A：分别取所述病毒释放缓冲液和病毒胚液；

步骤B：将病毒胚液中速离心，即以6000-9000r/min的速率离心15-60min，分离沉淀一和上清液一；

步骤C：按沉淀质量：病毒释放缓冲液质量1∶10-100向所得沉淀中加入所述病毒释放缓冲液，混合均匀后，在2-8℃以1000-5000r/min的搅拌速率，搅拌10-30min，然后再次中速离心，分离沉淀二和上清液二，沉淀一中80％以上的病毒已经进入上清液二；

步骤D：所得上清液二和所得上清液一混合后横向切流浓缩；或将所得上清液二和所得上清液一分别横向切流浓缩后混合；横向切流浓缩所用的滤膜的孔径为10-500KDa，胚液浓缩倍数为浓缩2-10倍；得到病毒胚液的浓缩液。

考虑到过滤速度和病毒损失率，较佳地，采用为30-150KDa孔径的滤膜，更佳地，采用为50-100KDa孔径的滤膜最好。

用所述病毒释放缓冲液制备多联苗的方法，包括如下具体步骤：

步骤A：分别取所述病毒释放缓冲液和病毒胚液；