[发明专利]糖类抗原15-3时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒，特别是涉及一种糖类抗原15-3时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒。

背景技术

糖类抗原15-3(CA 15-3)是分子量约40万的粘蛋白型糖蛋白，由肿瘤细胞分泌并释放于血循环中。由于其最初由两株单克隆抗体DF3和115D8识别，因此定名为CA 15-3。研究结果表明CA 15-3是用于乳腺癌随访监测和疗效判断的最佳标志物之一，对协助判断乳腺癌的分化程度、肿瘤预后、转归、评价疗效等都具有重要意义。CA15-3对于病人术后复发情况的监测，特别是癌症转移患者的术后监测是非常有用的。另外，卵巢癌、肺腺癌、子宫癌、结直肠癌、胰腺癌等以及一些良性乳腺疾病CA15-3也升高。CA 15-3也用于和其它肿瘤标志物联合测定以提高多种癌症诊断的检出率。

目前血清CA 15-3检测主要有酶联免疫法(ELISA)、免疫放射法(IRMA)。由于受示踪剂性状的限制，ELISA的灵敏度不高，检测范围有限，IRMA试剂盒受同位素半衰期的影响，有效期短，此外还有一定的放射性污染。

时间分辨免疫荧光分析(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)利用具有独特荧光特性的镧系元素，代替霉、同位素等，作为发光免疫分析中的一种重要方法，具有灵敏度高、示踪物稳定、不受样品自然荧光干扰、无放射性污染等许多优点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种糖类抗原15-3时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒。通过本发明的方法，能解决现有技术中关于CA 15-3检测存在的灵敏度低、稳定性差、操作繁琐及污染环境等技术问题。

为解决上述技术问题，本发明的糖类抗原15-3时间分辨免疫荧光分析法，包括步骤：

①固相抗体制备

将抗糖类抗原15-3单克隆抗体稀释后，作为包被液，包被固相材料，形成具有固相抗体的固相材料；

②镧系元素离子标记抗体制备

选用配对抗糖类抗原15-3单克隆抗体，用常规方法进行镧系元素离子标记，形成标记抗体；其中该标记抗体与步骤①抗体分别结合糖类抗原15-3不同的抗原决定簇，从而形成夹心复合物。

③在步骤①制得的具有固相抗体的固相材料中，加入糖类抗原15-3标准品或待测样品，以及反应缓冲液，经孵育、洗涤固相材料后，加入稀释的标记抗体，再次孵育后进行荧光检测。

所述步骤①中，具体制备步骤，包括：

(1)将抗糖类抗原15-3单克隆抗体用包被缓冲液稀释至抗体浓度为1.0～10.0μg/ml，作为包被液，与固相材料接触并静置5～24小时；

其中，包被缓冲液包括：pH 7.2-7.6的50mM磷酸盐缓冲溶液；

固相材料包括：微孔反应条、或由微孔反应条形成的微孔反应板；

(2)用含表面活性剂的缓冲液，洗涤步骤(1)制备的抗体包被的固相材料后，加入含封闭蛋白的缓冲液，静置3～12小时；

其中，含表面活性剂的缓冲液，包括：含0.1％Tween-20的50mM pH7.8TSA缓冲液，而50mM pH 7.8TSA缓冲液为50mM Tris，含150mM NaCl、1％BSA、16％的蔗糖；

含封闭蛋白的缓冲液，包括：含0.5％酪蛋白的0.1％Tween-20的50mM pH7.8TSA缓冲液；

(3)弃去含封闭蛋白的缓冲液，干燥固相材料，完成固相抗体制备。

所述步骤②中，镧系元素离子包括：Eu³⁺、Sm³⁺、De³⁺、Te³⁺等，优选为Eu³⁺。镧系元素离子与抗糖类抗原15-3单克隆抗体的质量比为1∶2-1∶1。

所述步骤③中，糖类抗原15-3标准品的制备方法为：先分别将糖类抗原15-3稀释至所需的最高浓度，再采用倍比稀释法稀释至所需浓度，获得糖类抗原15-3标准品；其中，该标准品优选为用含20％小牛血清、0.1％NaN₃的生理盐水将糖类抗原15-3配制成标准品；

反应缓冲液包括：pH 7.6-8.0的50mmol/L Tris-HCl，内含0.9％NaCl、2％BSA、0.05％牛IgG、0.1％Tween-20和0.1％NaN₃；