[发明专利]一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法有效

申请号：	201210037245.2	申请日：	2012-02-17
公开（公告）号：	CN102558382A	公开（公告）日：	2012-07-11
发明（设计）人：	吴强;罗力心;关晓峰;伍长华	申请（专利权）人：	成都欧林生物科技股份有限公司
主分类号：	C08B37/00	分类号：	C08B37/00;A61K39/02;A61K39/102;A61P31/04
代理公司：	成都金英专利代理事务所(普通合伙) 51218	代理人：	袁英
地址：	610000 四***	国省代码：	四川;51
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摘要：
搜索关键词：	一种流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化方法
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【说明书】：

技术领域

本发明涉及疫苗领域，具体涉及一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法。

背景技术

在Hib疫苗制备的过程中，荚膜多糖的制备是关键的步骤。在我国多采用和流行性脑膜炎球菌以及伤寒Vi多糖提取相似的工艺来提取荚膜多糖。此工艺采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)与酸性多糖形成季胺络合物从而沉淀多糖。但是CTAB对核酸、蛋白质也有不同程度的沉淀作用，因此要获得纯度较高的荚膜多糖，必须进一步去除沉淀的核酸和蛋白质。常规的去除蛋白质的方法是用苯酚抽提去除蛋白质。但是该工艺的缺点是会产生大量的废弃苯酚，苯酚是一种强腐蚀性的高毒性物质，对环境有严重危害，对水体和大气可造成污染。苯酚对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能。人吸入高浓度苯酚气体可致头痛、头晕、乏力、视物模糊、肺水肿等。因此，对去除蛋白质的工艺进行改进是有实际意义的。

羟基磷灰石是磷酸钙的一种形式，具有独特的选择性和分辨率，经常能够分离一些其他技术无法区分的生物分子。羟基磷灰石填料广泛用于核酸、蛋白、病毒以及其他大分子的分离纯化。当前还没有将羟基磷灰石用于b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化的工艺。

发明内容

本发明的目的即在于克服现有技术的不足，提供一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法，该方法不使用苯酚来进行荚膜多糖的纯化，减轻了对环境的危害和对人体的损害，并且得到的Hib荚膜多糖纯度可达到行业标准。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法，包括以下步骤：

A.装填一根羟基磷灰石层析柱，用20mM磷酸盐缓冲液平衡2个柱体积直至基线平稳；

B.将b型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜多糖粗糖溶解于20mM磷酸盐缓冲液，将得到的Hib荚膜多糖粗糖溶液上样于层析柱上；

C.使用20mM磷酸盐缓冲液洗2个柱体积，收集流穿峰；

D.用高盐缓冲液洗脱结合在层析柱上的蛋白质，再生层析柱；

E.将收集的流穿峰用G-25葡萄糖凝胶柱进行缓冲液置换，流动相为无热原的注射用水，收集含Hib荚膜多糖的洗脱峰，最终得到Hib荚膜多糖精糖原液。

在上述步骤中，Hib荚膜多糖粗糖是通过对Hib样本进行处理得到的沉淀物。

在上述步骤中，20mM磷酸盐缓冲液的pH值为6.9。