[发明专利]一种检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法，利用该方法可以测定处于不同生长时期时烟叶中的糖、氨基酸、有机酸、酚、萜醇等多种次生代谢物质，是一种高通量测定方法。

 

背景技术

烟草作为重要的模式作物及经济作物，人们对其化学组成有了很多了解。但是，大多数研究仅限于对调制后烟叶的了解，而人们对于新鲜烟叶，包括不同生长周期、不同部位烟叶的化学组成了解仍旧十分有限。次生代谢物主要是指分子量在1000以下的小分子代谢物，与植物基体抗性、信号传导、生长发育、植物的花色、香气等现象相关。因此，了解不同时期、处于不同生长周期的烟叶的代谢物组成及含量本身具有重大意义，而且是开展基因组学、蛋白质组学、转录组学研究的化学平台。

 尽管近几年国内外已经开始开展关于烟叶次生代谢物的研究工作，但是数量有限，且大都研究针对调制后烟叶。调制过程中，烟叶化学成分不断发生化学变化，而且不同类型烟叶调制方法不同，难以进行控制。因此，分析调制后烟叶的次生代谢物并不能反应烟株的真实代谢过程。而建立一种检测新鲜烟叶中次生代谢物的方法是十分必要的。衍生化GC-MS方法可以同时检测烟叶中有机酸、氨基酸、胺、酚、醇、糖等大多数代谢物，具有高通量特征，而且目前还无采用衍生化GC-MS测定新鲜烟叶中代谢物的相关报道。

 

发明内容

本发明的目的正是针对上述现有技术状况而专门提供一种检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法。利用该方法可以测定处于不同生长时期时烟叶中的糖、氨基酸、有机酸、酚、萜醇等多种次生代谢物质，是一种高通量测定方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化GC-MS方法：快速采集新鲜烟叶并用液氮现场进行速冻，采用冷冻干燥方法除去水分后对烟叶进行粉碎，用溶剂超声提取烟粉中次生代谢物，对提取液上清液进行干燥，然后对干燥后提取物进行肟化反应、硅烷衍生化反应，最后采用GC-MS进行分析。

具体步骤如下：

(1) 烟叶的采集、处理、干燥、粉碎：快速采摘烟株指定部位烟叶，用液氮迅速冷冻以终止生命过程，冷冻干燥24h以除去烟叶水分，干燥过的烟叶粉碎至40-60目，放于-20℃冰箱保存；

(2) 烟叶中次生代谢物的萃取：称量10-30mg粉碎后的烟叶于1.5ml离心管中，加入内标溶液，用甲醇-氯仿-水萃取溶剂超声提取，超声萃取后离心，取上清液并用氮吹仪吹干；

(3)肟化反应：向吹干的提取液基质中加入甲氧胺盐酸盐溶液，斡旋震荡后在30-40℃下反应70-100min；此步骤的目的是对糖等化合物的醛基进行肟化反应以防止其成环，从而减少其异构体，便于定量比较。

(4)硅烷化衍生反应：在步骤（3）之后，向离心管中加入N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺（MSTFA），斡旋震荡后在30-40℃下衍生 25-35min；

(5) 检测：采用GC-MS进行检测分析。色谱条件如下：

色谱柱： DB-5ms (30m×0.25mm×0.25μm)； 载气，He；流速：1.0ml/min；进样口温度：290℃；进样量：1μL；分流比为10:1；升温程序：                                               60℃保持4min，然后以5℃/min的升温速度升到310℃，保持10 min，

MS参数：采用全扫描模式；采集质量数范围：40-510。

所述内标溶液为用萃取溶剂配制的氘代十六烷酸溶液。

所述萃取溶剂甲醇-氯仿-水的配比为5∶2∶2。

所用甲氧胺盐酸盐溶液浓度为20-40mg/ml，配置在吡啶溶液中，加入量为30-70μl；反应采用水浴或摇床（空气加热）进行控温。

衍生化试剂三甲基硅烷基三氟乙酰胺的加入量为30-120μl，反应采用水浴或摇床进行控温。

在步骤（1）的处理过程中要迅速去处烟叶主脉，用锡箔纸包裹叶片部分，标记后放入液氮中终止烟叶生命过程，并放于-80℃低温冰箱冷冻保存，在烟叶从冰箱取出至冷冻干燥开始之前，必须用干冰包埋，进行转移。