[发明专利]一种恶性疟疾疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种恶性疟疾疫苗及其制备方法，尤其涉及恶性疟疾疫苗制备中重组质粒和重组病毒的制备，属于生物医药技术领域。 

背景技术

疟疾是当今世界对人类危害最为严重的传染性疾病之一。据WHO最新估计，全球每年发生3亿-5亿起急性感染病例，有100多万人因这一疾病而死亡，其中大多数为非洲撒哈拉以南地区5岁以下的儿童。近年来，由于耐药性疟原虫株和耐药蚊媒的不断产生和扩散，使疟疾控制形势更为严峻。因此，研制有效的疟疾疫苗，成为控制疟疾的发病率和病死率迫切需要解决的课题。 

在众多的疟疾疫苗候选抗原中，恶性疟原虫裂殖子顶端膜抗原1(apical membrane antigen-1，AMA-1)在裂殖子入侵宿主红细胞过程中发挥重要作用，有希望的抗疟原虫感染的疫苗候选分子。随着AMA1分子生物学研究的深入，人们开始研制AMA1亚单位疫苗，目前世界上生物技术常用的生物体是大肠杆菌和酵母，用大肠杆菌表达的AMA1蛋白无免疫原性和保护性，而酵母表达AMA1也不能产生有效的中和抗体。哺乳细胞表达系统(CHO)等表达系统虽然效果好，但因表达量低，同时需大量培养基和牛血清蛋白，成本高，不适合生产需要。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种克服上述缺陷的恶性疟疾疫苗。本发明通过构建一种家蚕重组杆状病毒，并运用重组杆状病毒表面展示技术构建表达恶性疟原虫主要抗原AMA1胞外域的重组杆状病毒Bmgp64AMA1，以家蚕蛹作为生物反应器生产重组杆状病毒，并以此重组杆状病毒作为疟疾疫苗原生产疫苗，相比传统疫苗生产具有安全性好、生产成本低、产量高、易于操作、适用于大规模生产的特点。 

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下： 

一种家蚕重组杆状病毒Bmgp64AMA1，该病毒于2011年12月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为家蚕核型多角体病毒 (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus），保藏编号为CGMCC No.5601。

上述家蚕重组杆状病毒Bmgp64AMA1的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 

(1) 由PCR扩增的方法获得杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列，分别通过BamH I /EcoRI和Xho I /HindⅢ双酶切插入pFastBacI载体多克隆位点上下游两端构建的表面展示载体pFastBacI-gp64；

(2) 由PCR扩增的方法获得恶性疟原虫主要抗原AMA1胞外域基因序列，其5’和3’端分别引入EcoR I和Xho I酶切位点后，连接到步骤(1)所得表面展示载体pFastBacI-gp64，构建成重组转移质粒pFastBacI-gp64-AMA1；

(3)取步骤(2)所得的重组转移质粒pFastBacI-gp64-AMA1转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养板上进行蓝白斑筛选，避光培养40~48h后挑取白斑，培养20~24h后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组，并用M13通用引物做PCR鉴定;

(4) 取步骤(3)鉴定成功的重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得一代病毒悬液0~4℃保存，提取病毒基因组用M13通用引物进行PCR鉴定，获得所述家蚕重组杆状病毒Bmgp64AMA1。

本发明还提供上述家蚕重组杆状病毒Bmgp64AMA1表达的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。 

上述蛋白的制备方法包括以下步骤： 

将上述家蚕杆状病毒Bmgp64AMA1感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增；

针刺接种法接入家蚕五龄幼虫或蚕蛹；

收集表达的上述蛋白。

本发明进一步提供上述重组杆状病毒Bmgp64AMA1在制备恶性疟疾疫苗中的应用。 

本发明还提供上述蛋白在制备恶性疟疾疫苗中的应用。 

本发明实现的技术效果如下： 

利用家蚕幼虫、蛹作为生物反应器，家蚕杆状病毒表达系统高效表达具有极高临床应用价值疟疾疫苗的方法，本方法适用于大规模生产，降低了成本，且产量高，所生产的疟疾疫苗应用价值大；