[发明专利]基于多重放大系统的检测玉米赤霉烯酮的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物检测工程技术领域的方法，具体是一种快速检测谷物类、谷物类相关产品、饲料中玉米赤霉烯酮的方法。

背景技术

玉米赤霉烯酮毒素(Zearalenone，ZEN)是镰刀菌在一定湿度和温度条件下繁殖所产生的次级代谢产物。玉米赤霉烯酮毒素可存在于玉米、小麦、大麦、高粱、黑麦等谷物，也可存在于食用含ZEN饲料的动物组织中，包括牛奶、鸡蛋等。玉米赤霉烯酮毒素与自发性乳腺癌，输卵管和子宫水肿、增生，精细胞畸变、凋亡等疾病有关。玉米赤霉烯酮毒素具有分布广泛、残留时间长、难处理、和其他毒素一起有增强毒性的现象。加入WTO之后，农产品及相关食品的国际贸易量日益增加，随之对进出口产品的生物安全性的要求也越来越高，为了保证这类产品的顺利上市和食用者的健康，出入境检疫、海关、生产企业、监督部门等部门迫切需要一种快速简便的玉米赤霉烯酮毒素检测方法。

化学发光(Chemiluminescence，CL)早在19世纪80年代就得到证实，即在化学反应过程中瞬间以释放光子的形式放出能量。后发展出放射免疫分析技(Radioimmunoassay，RIA)，因其高灵敏度和高特异性而受到普遍应用。CLIA是在RIA基本理论的基础上，以标记发光剂为示踪物信号建立起来的一种非放射标记免疫分析法。近年来发展迅猛，是目前发展和推广应用最快的免疫分析方法，也是目前最先进的标记免疫测定技术，灵敏度和精确度比酶免法、荧光法高几个数量级，显著优于放射免疫分析和酶联免疫分析。

化学发光酶免疫分析(Chemiluminescent Enzyme Immunoassay，CLEIA)属酶免疫分析，只是酶反应的底物是发光剂，操作步骤与酶免疫分析完全相同：以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。在酶促化学发光免疫分析中可供标记的酶有很多，目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)。

免疫磁酶技术是将IgG标记在标记有Protein A的磁珠上，进行酶联免疫方法的技术。其优势是利用磁珠的富集作用，检测较大体积溶液中的微量抗原。链霉亲和素-生物素系统在方法中使用，是由于链霉亲和素可以和4个生物素稳固结合，因此在信号放大方面被广泛使用。

关于玉米赤霉烯酮毒素检测，国内外已建立了多种方法。目前检测ZEN的方法主要为高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱-质谱联用法(GC-MS)，液谱和质谱联用法(LC-MS)和ELISA方法。然而，这些方法需要对检测样品进行严格的预处理，还需要高效液相色谱仪等贵重仪器，同时要求有专业的操作人员，不利于现场常规检测使用。已有的检测玉米赤霉烯酮毒素的ELISA试剂盒，在检测灵敏度上不及本发明的超灵敏化学发光ELISA方法，因此本方法对保障谷物类食品的安全具有更重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于多重放大系统的检测玉米赤霉烯酮的方法，本发明检测对象针对性强，准确率高，灵敏度较市售ELISA检测试剂盒高。并且由于本发明采用抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体，与其他谷物中的真菌毒素无交叉反应，较市售的以多克隆抗体为基础的ELISA试剂盒有更强的特异性，减少了假阳性率。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于多重放大系统的检测玉米赤霉烯酮的方法，该方法包括以下步骤：

步骤一，将ZEN半抗原与OVA偶联，得到偶联物ZEN-OVA，再与biotin偶联，得到偶联物OVA-ZEN-biotin；

步骤二，将抗ZEN单克隆抗体与免疫磁珠结合，得到抗体-磁珠结合物；

步骤三，将所述抗体-磁珠结合物加入EP管中，用洗涤液洗涤，对待侧样品进行萃取，将待侧样品的萃取液稀释后加入上述管中，震荡；

步骤四，去除上清液，用洗涤液洗涤，再加入所述OVA-ZEN-biotin，震荡；

步骤五，去除上清液，用洗涤液洗涤，再加入SA-HRP，震荡；

步骤六，去除上清液，用洗涤液洗涤，加入发光底物，震荡，测定发光值；

步骤七，根据已知不同浓度ZEN与抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体加入后得到的发光值，制作标准曲线，再根据待测样品的发光值，通过标准曲线得到样品中的ZEN浓度。

优选地，在所述步骤一中，所述ZEN半抗原与所述OVA的偶联通过活泼酯法完成。

优选地，在所述步骤一中，所述偶联物ZEN-OVA与所述biotin的偶联通过活泼酯法完成。