[发明专利]一种体外诱导人羊膜上皮细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外诱导人羊膜上皮细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法。

背景技术

人羊膜上皮细胞（human amniotic epithelial cell, hAECs）具有干细胞特性，在适宜诱导条件下可分化成内皮和肝上皮样细胞、心肌细胞样细胞、神经元样细胞、成骨细胞等。此外，hAECs还具有低免疫原性、来源丰富、易于富集、扩增能力强、不牵涉医学伦理问题等优势，在再生医学中具有广泛的应用前景。

Ⅰ型糖尿病的发生与遗传因素、环境因素及免疫机制有关，其根本的病因病机是胰腺B细胞破坏致胰岛素分泌不足。Ⅰ型糖尿病病人必须终生依赖胰岛素治疗才能维持生命。尽管胰腺或胰岛移植移植可望成为治疗Ⅰ型糖尿病的理想方法，但因其组织供源、免疫排异、技术难度等问题而受颇多限制。鉴于hAECs具有多系分化能力和免疫豁免特性，诱导其分化为胰岛素分泌细胞（insulin secreting cells，ISCs）为治疗Ⅰ型糖尿病提供新的供体细胞无疑具有重要的应用价值。

发明内容

本发明解决的技术问题：克服现有技术存在的问题，本发明提供一种使hAECs分化为ISCs的诱导方法。

本发明采用的技术方案：一种体外诱导人羊膜上皮细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，包括以下步骤： 

（1）分离hAECs：采用机械法剥离胎盘羊膜组织，用D-Hank’s液反复冲洗，除尽表面血迹，剪碎羊膜后分装于离心管内，加入含有0.02%EDTA 的0.05%胰蛋白酶溶液，37℃消化10 min，弃消化液；37℃、200 r/min旋转消化30 min，250目不锈钢网过滤，收集单细胞悬液，加含10%胎牛血清的培养基终止消化；组织碎片用同样方法重复消化2次；合并3次收集的细胞悬液经300目不锈钢网过滤，滤液1500 r/min离心10 min，弃上清，再悬浮细胞；800 r/min离心6 min，弃上清，收获细胞即为人羊膜上皮细胞；用低糖-DMEM培养基（含10%的胎牛血清和10 mg/L表皮生长因子）重新悬浮细胞，以3×10⁸ L^-1细胞密度接种于T₂₅培养瓶，置37℃、饱和湿度、体积分数为5%CO₂培养箱中培养；备作CK-19检测；

（2）鉴定hAECs：取第2代hAECs行波形蛋白和CK19免疫组织化学染色，hAECs表达CK19而不表达波形蛋白；用流式细胞仪检测CD29、CD73、CD166、 CD34和CD45，hAECs的表型特征为高表达CD29、CD73和 CD166，但不表达CD34^—CD45；

（3）诱导hAECs向ISCs分化：诱导分化培养基为含10mmol/L尼克酰胺和N₂补充物（含牛血清白蛋白、胰岛素、亚硒酸钠、腐胺和黄体酮）的无血清HG-DMEM培养基（购自Gibco公司，货号：12800-017；葡萄糖含量为4500mg/L）；取第2代hAECs用诱导分化培养基悬浮，以2.5×10⁶个/ml细胞密度接种于6孔培养板，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%CO₂培养箱中培养7天，第三天用诱导分化培养基换液1次，hAECs经上述诱导培养其诱导培养7天即分化为ISCs；

（4）ISCs的鉴定：hAECs诱导培养7天后，①取培养物上清液，采用放射免疫法检测胰岛素含量；② 收集部分细胞，采用逆转录-聚合酶链反应（PT-PCR）检测胰岛素基因mRNA和调节胰腺发育及胰岛B细胞分化的关键性转录因子胰十二指肠同源异型盒因子-1（pancreatic and duodenal homeobox factor-1, PDX-1）基因mRNA的表达。

本发明达到的有益效果：PDX-1是调节胰腺发育和胰岛B细胞分化的关键性转录因子，不但参与早期阶段胰腺的特化及胰芽的形成，还参与胰腺细胞的分化。hAECs经上述诱导培养7天有胰岛素基因和PDX-1基因表达，培养物上清中的胰岛素含量达320μIU/ml以上，说明hAECs分化为ISCs。但未经诱导的hAECs既无胰岛素基因mRNA的表达，也检测不到胰岛素。本发明方法可在体外诱导hAMSCs分化为ISCs。经本发明方法产生的ISCs及含有ISCs组合物可用于Ⅰ型糖尿病Ⅰ型糖尿病。

具体实施方式

实施例

一种体外诱导人羊膜上皮细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，包括以下步骤：