[发明专利]黄鳝血清转铁蛋白及其制备方法与用途

说明书

技术领域

本发明属于生物领域，公开了一种血清转铁蛋白的提取方法、结构和功能，具体地说是一种具有抗帕金森病活性、抗菌活性、抗衰老活性、和提高免疫作用的黄鳝血清转铁蛋白及其提取制备方法。

背景技术

转铁蛋白是一簇具有多种生物活性的β-球蛋白，主要包含三种典型蛋白：鸟类卵清及血清中的卵清转铁蛋白，哺乳动物乳清中的转铁蛋白和脊椎动物血清中的血清转铁蛋白。此簇蛋白都具有很好的增强机体免疫力的生理功能，能促进婴幼儿对铁及营养物质的吸收，有效防止贫血，抑制肠道致病菌和病毒体内自由基的生成，缓解类风湿关节炎和抗衰老。

黄鳝(Monopterus albus)，属合鳃鱼目，合鳃鱼科，黄鳝属。亦称黄鳝、罗鳝、蛇鱼、长鱼。为热带及暖温带鱼类。分布在中国东南部地区，在国外主要分布于泰国、印度尼西亚等东南亚地区。利用黄鳝来提取血清转铁蛋白，并将其制成有一定药理活性的药品或功能性保健食品，前景非常广阔。

据《本草纲目》记载，鱼类有补血、补气、消炎、消毒、除风湿等功效。文献报道，鱼类富含DHA和卵磷脂等构成人体各器官组织细胞膜的主要成分，而且是脑细胞不可缺少的营养。黄鳝所含的特种物质“黄鳝素”，能调节血糖，加之所含脂肪极少，因而是糖尿病患者的理想食品。常吃鱼类有很强的补益功能。黄鳝的血还可以治疗口眼歪斜。因此，我们选择在我国分布广泛的鱼类作为研究对象。

文献报道，皮建华制备了鳝鱼抗H血清(皮建华，邬于川，鳝鱼抗H血清的制备，中国法医学杂志，1998.13(4))。诸葛燕等对七种淡水鱼(草鱼，兰氏鲫，团头鲂，黄颡鱼，鳝鱼，泥鳅和北美白金鸭嘴)中天然色素和酪氨酸酶的活性进行了比较(诸葛燕，七种淡水鱼中天然色素和酪氨酸酶活性的比较，上海水产大学学报，2008)。

关于血清蛋白的研究报道，李亚南等于2001年对嗜水产气单胞菌诱导的草鱼免疫球蛋白进行了分析。分析时分为两组：一组样品经饱和硫酸铵分级沉淀、透析和电泳分析，另一组经Sephadex G-200柱层析分离及电泳分析(李亚南.嗜水产气单胞菌诱导的草鱼免疫球蛋白分析[J].动物学报，2001，47(2)：132-138)。冯娟等人于2002年利用Protein A-sepharose亲和柱层析一步法，对四种海水养殖鱼类的血清免疫球蛋白首次进行了分离纯化及分子量测定。层析曲线的洗脱峰值说明牙鲆血清的Ig同紫红笛鲷、青石斑鱼、尖吻鲈3种暖水性鱼类血清的Ig在结构和功能上有明显的差异(冯娟，四种海水养殖鱼类血清免疫球蛋白的分离纯化及分子量测定.热带海洋学报，2002.21(4))。2004年，李雅娟等人对黄颡鱼雌、雄个体血红蛋白进行了电泳分析。结果表明：黄颡鱼雌、雄个体血清蛋白存在明显差异，表现在B₁区雄性个体比雌性个体多1条MI带(染色较浅的带)。雌、雄个体血红蛋白只能分离出1条谱带，并且雌、雄之间基本没有差异(李雅娟等，黄颡鱼雌、雄个体血红蛋白的电泳分析，吉林农业大学学报，2004.26(3)：339-342)。

本专利的研究对象是人们经常食用的鱼类，人们主要是食用其肉质，血的利用率较低。为了提高鱼类血的利用率，通过研究其血清蛋白，开发一种具有药理活性的产品，是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是提供黄鳝血清转铁蛋白及其提取、分离和纯化方法。

本发明的另一目的是提供该血清转铁蛋白的用途。

本发明目的是这样实现的：

(1)血清的制备：取黄鳝新鲜血液在10℃～25℃下静置1～2h沉淀，得深红色块状物质；然后在0～4℃下静置12～24h后离心，弃去血细胞，取上清液即血清；

(2)球蛋白的提取：先将血清采用盐析法提取，步骤为，加入0.8～1.2倍体积饱和盐溶液，混合均匀，于0～10℃静置，使之充分沉淀，冷冻离心，弃去上清；

以0.008～0.012mol/L、pH值6.8～7.2的磷酸盐(PBS)缓冲液溶解沉淀，再逐滴加入0.8～1.2倍体积的饱和盐溶液，混匀，在0～4℃静置沉淀，得蛋白粗提物；优选的饱和盐溶液为饱和硫酸铵、饱和辛酸-硫酸铵溶液或饱和硫酸钠溶液。

(3)蛋白纯化：采用离子交换柱层析纯化。

层析介质用pH值6.8～7.2、0.008～0.012mol/L的PBS缓冲液充分平衡，装柱；离子交换柱的层析介质优选为阴离子交换树脂或DEAE-纤维素。