[发明专利]Na+/H+逆向转运蛋白Nha-K2及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种Na⁺/H⁺逆向转运蛋白Nha-K2及其编码基因与应用。

背景技术

由于全球气候变暖，世界人口不断增加，工业污染加剧，灌溉农业的发展，化肥使用不当等因素，土壤盐渍化日趋严重，这不仅使得土壤荒漠化、生态环境进一步恶化，并且已经成为阻碍作物生长发育及高产优质的主要因素。目前，解决问题的主要途径还是传统改良盐渍土的方法，如淡水洗涤、合理灌溉和使用CaCO₃等。但是，传统措施投资大、效益低，并且随着大量化学物质的加入会加剧土壤的次生盐渍化，这迫使人们考虑采用其它措施来改良利用盐渍土壤。随着生物技术的发展，培育抗盐渍、耐干旱的适宜在盐渍土壤上生长并具有较高经济和生态价值的植物品系，是开发利用盐渍土壤的一条经济而有效的途径。所以对耐盐基因的研究成为当今的研究热点。

在自然界中存在着大面积自然形成或者人工形成的各种各样的盐碱环境，如海洋、盐(碱)湖、盐场、盐碱地以及腌制品等为一般生物生长和存活的极限，但却生长着能适应这种极端环境的微生物，我们把这类微生物称为耐盐微生物或嗜盐微生物。根据细菌对NaCl的需求和最适生长需要的NaCl浓度，可将细菌分为四类：(1)非嗜盐菌：生长不需要NaCl，低浓度的NaCl(＜1％)就会对它们的生长产生抑制作用；(2)轻度嗜盐菌：生长需要少量的NaCl，其最适生长的NaCl浓度为1～3％；(3)中度嗜盐菌：生长离不开NaCl，它们可在0.1～32.5％的条件下生长，最适生长NaCl浓度为3～15％；(4)极端嗜盐菌：一般在9％NaCl以上生长，可在9～35％浓度范围内生长，最适生长NaCl浓度为13～15％。其中中度嗜盐菌和极端嗜盐菌属于极端环境微生物。中度嗜盐菌和极端嗜盐菌大多存在于海洋、盐(碱)湖、盐场、沙漠植物、盐碱地和盐渍食物等高盐环境中。

嗜盐或耐盐微生物在盐域环境中，一方面细胞通过积累亲和性溶质，例如糖、多元醇、氨基酸和氨基酸衍生物等，积累过程既可以通过自身合成也可以通过环境摄入；另一方面细胞将多余的Na⁺排除细胞外，以维持胞内较低的盐浓度，从而维持细胞正常的形态、结构和生理功能。Na⁺输出系统又称为钠离子(或单价阳离子)/氢离子逆向转运蛋白，或简称为Na⁺/H⁺逆向转运蛋白(Na⁺/H⁺antiporter)，广泛存在于微生物(包括细菌和真菌)、植物和动物细胞中。Na+/H+逆向转运蛋白属于跨膜蛋白，催化单价阳离子(如Na⁺、K⁺、Li⁺)输出，该过程与质子(H⁺)的输入相偶联。嗜盐或耐盐微生物将进入细胞内的Na+再排到细胞外，主要就是通过次级Na⁺/H⁺逆向转运蛋白实现的。目前研究的单亚基逆向转运蛋白主要有NhaA、NhaB、NhaC、NhaD、NhaE、NhaG、NhaP、ChaA和MdfA等。

大肠杆菌有4个不同的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，分别是NhaA、NhaB、ChaA和MdfA。ChaA除能输出Na⁺交换H⁺外，还能输出Ca⁺与H⁺交换，NhaA(简称Ec-NhaA)是大肠杆菌适应在高浓度Na⁺、L⁺及碱性pH下生长所必需的主要逆向转运蛋白。NhaB赋予大肠杆菌一定的耐盐性，但在NhaA缺失条件下，NhaB在维持细菌生长方面起着重要作用。nhaA和nhaB双缺失突变后，大肠杆菌变成盐敏感突变株，在含0.2M NaCl培养基上不能生长，该突变株(nhaA^-和nhaB^-)被广泛用于通过功能互补的基因克隆中。

在嗜盐微生物中，中度嗜盐菌是一个对盐浓度耐受范围最广的类群，在自然界分布广泛，具有独特的基因类型、特殊的生理机制、多样化的代谢产物和潜在的应用价值。因此大量获取其基因资源，得到更好、更多的转基因材料具有重要的研究意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种中度嗜盐菌Na⁺/H⁺逆向转运蛋白Nha-K2及其编码基因。