[发明专利]玉米逆境胁迫诱导型启动子的克隆及功能分析

说明书

技术领域

本发明属生物工程技术领域，具体涉及一种源自于玉米阴离子过氧化物酶基因(ZmapH)，并可在玉米中高水平表达的诱导型启动子序列。

背景技术

干旱生态危机已严重影响到人类的可持续发展，因此在农业生产中，急需耐旱、水分胁迫环境下生长良好的粮食作物和植被。随着现代基因工程技术的迅速发展，植物耐旱已从传统的植物生理研究转向分子方面的研究。作物分子育种技术使得以基因水平替代原先的染色体组水平来精细地调节育种的作用成为可能。

高等植物基因的表达调控已成为分子生物学研究领域的热点，启动子是基因表达调控的重要元件。深入研究启动子的结构和功能，建立可用于植物转基因表达的时、空、量三维调控系统，可为功能基因组学研究及通过基因工程技术精确地调节植物代谢提供全新的思路。

选择适宜的启动子来驱动目的基因在转基因植物中表达，已成为植物基因工程研究的热点问题之一。针对不同的目的基因，人们选用不同的启动子，从而使靶基因在特定组织或条件下选择性表达，以利于转基因植物的正常生长发育(赵恢武等，2000；刘强等，2000)。对植物在干旱逆境下大量表达的耐旱基因启动子研究表明，不同耐旱基因的启动子往往含有相同的顺式作用元件，并受相同的反式作用因子的调控。这为我们提供了另外一条研究植物耐旱机制的途径。

国内外科学家利用一些耐旱相关的特异性启动子(如RD29A)、特异性蛋白(如脱水素)、耐旱相关的特异性酶(如TPS)基因进行植物遗传转化并获得了成功，得到一些耐旱品质明显提高的转基因植株。清华大学的刘强等(2002)将来自拟南芥的干旱诱导型基因RD29A的两个转录调控因子转入拟南芥后发现拟南芥的干旱耐受性能有很大提高。高世庆(2006)通过基因枪介导转化小麦幼胚愈伤组织，经过分子生物学检测及在PEG胁迫下的GUS组织化学染色证实了RD29A启动子在小麦愈伤组织中能够诱导GUS基因的表达。也有科研工作者直接利用干旱诱导型启动子启动某些耐旱有关的蛋白表达进行植物耐旱机理的研究。如：利用特异性的启动子启动与耐旱有关的基因(如：脱水素基因等)或特异性的渗透调节物合成酶基因在烟草、拟南芥等模式植物体内表达获得耐旱植株；通常情况下在双子叶植物中常用的组成型启动子CaM35S启动海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)在烟草和拟南芥中均获得耐旱植株，而用诱导型启动子RD29启动TSP(海藻糖-6-磷酸合酶)在烟草中表达，获得了较为明显的耐旱烟草植株。单子叶植物的Ubiquitin-promoter有两部分组成：exon和intron，其中intron具有增强子的功能。目的基因在其启动下能够大量稳定的在单子叶植物体内表达。浙江大学郝中娜等(2005)对水稻OsWRKY19及OsWRKY89基因的启动子进行功能研究，表明这两个基因的启动子是组织特异性表达的诱导型启动子。Brown等(2010)首次发现冬小麦blt101基因启动子内存在高度保守的TCA-like元件与诱导目的基因在低温胁迫下高效表达密切相关。Takumi(2003)等分离了小麦低温应答基因家族基因Wcor15上游的启动子序列证实该启动子受低温和光诱导。

利用干旱诱导型启动子驱动抗旱基因的高效表达，从而改良作物的耐旱性成为目前研究的热点。然而，目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因此，对于新的抗旱相关启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用，以及与这些元件互作的转录因子的研究仍然是今后启动子研究的重点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种逆境胁迫诱导型启动子序列，该启动子序列能够诱导目标基因高水平表达，而且该启动子来源于玉米阴离子过氧化物酶基因(ZmapH)。

本发明的第二个目的是提供一种用于植物转化的逆境胁迫诱导型启动子载体，该载体指导高水平表达目标基因ZmapH的逆境胁迫诱导型启动子序列和5′非翻译区。

本发明的第三个目的是提供一种所述载体转化的转基因植物。该转基因植物能反映启动子诱导活性的高低。

为实现上述目的，本发明克隆了玉米阴离子过氧化物酶基因(ZmapH)的逆境胁迫诱导型启动子区，并构建了用于植物转化的载体，所述载体包含带有ZmapH基因的5′非翻译区的上述启动子。随后利用所述载体在玉米中诱导表达，并观察到该启动子与逆境胁迫诱导性相关的高水平活性。

本发明提供一种获得的玉米逆境胁迫诱导型启动子序列，包含相对于SEQ ID NO：1的转录起始位点的-1bp至-1150bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，逆境环境可以在植物中诱导本发明所述的启动子的高水平活性。