[发明专利]一种免疫亲和层析介质的制备方法及在纯化河豚毒素中的应用

权利要求书

1.一种免疫亲和层析介质的制备方法，其特征是由固相载体和河豚毒素特异性抗体组成，包括以下步骤：

（1）先将固相载体经溴化氰法活化；

（2）取河豚毒素特异性抗体与溶胀后的活化固相载体置于pH 6.0-7.5，0.1-0.5 mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液中在室温下振荡偶联，其中抗体与溶胀后的活化固相载体的质量比为1: 100；

（3）将上述偶联凝胶产物转入其5-10 倍体积的pH 6.0-7.5，含有0.1-0.5 mol/L 醋酸的Tris-HCl缓冲液中，室温下振荡反应2 h进行封闭；最后用5-10 倍于封闭后凝胶体积的pH 6.0-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤2-4 次；

所述的固相载体可为交联葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶、交联琼脂糖或多孔玻璃等。

2.根据权利要求1所述的免疫亲和层析介质的制备方法，其特征是固相载体为交联琼脂糖。

3.权利要求1所述的免疫亲和层析介质的制备方法制备的免疫亲和层析介质用于河豚毒素纯化的方法，包括以下步骤：

（1）含有河豚毒素的样品前处理；

（2）河豚毒素免疫亲和层析柱的制备：

将得到的免疫亲和介质填充入固相萃取柱中，加入pH 6.0-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液后自然沉降，制成河豚毒素特异性抗体免疫亲和柱，于4℃保存待用；

（3）上样，将含河豚毒素样品以每分钟1-4ml 的流速通过预先用缓冲液平衡好的装有上述免疫亲和层析介质的层析柱；

所说的缓冲液平衡免疫亲和层析柱包括如下步骤：将pH6.0-7.0 的缓冲液以每分钟1-4ml 的流速通过装有免疫亲和层析介质的层析柱，用量为层析柱体积的3-10 倍，通过紫外检测保证层析柱己平衡至基线；

（4）洗脱，然后用 pH6.0-7.0的缓冲液清洗上样后的免疫亲和层析柱，再用pH 为4.5-6.5 的洗脱液以每分钟1-4ml 的流速将河豚毒素从层析柱上洗脱并收集洗脱峰，洗脱液的用量为层析柱体积的3-10倍；

（5）收集洗脱液；

所述的河豚毒素纯化方法步骤（3）、（4）中的pH6.0-7.0 的缓冲液选自PBS、Tris-HCl、醋酸-醋酸钠缓冲液中的一种或两种以上，所述的pH 为4.5-6.5的洗脱液选自醋酸-醋酸纳、柠檬酸-柠檬酸纳缓冲液中的一种或两种以上。