[发明专利]制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法的方法。

背景技术

目前，生产转基因动物的方法有原核内显微注射法、精子载体法、脂质体转染法、反转录病毒载体法、以及细胞核移植方法，但这些方法皆因成本高、转基因效率低或者插入片段小等缺点而无法广泛应用。慢病毒载体法的出现，不仅克服了以往逆转录病毒表达沉默的缺陷，而且转基因的效率远远高于传统的显微注射法，是转基因动物研究领域的突破性进展。随后，利用该方法，已经有转基因猪、转基因牛、转基因鼠、转基因鸡、绵羊、猕猴等出生。

在我国，朱作言等就通过显微注射的方法获得了转草鱼生长激素的转基因鲤鱼，黑龙江水产研究所也通过同样的方法获得了转大马哈生长激素基因的转基因鲤鱼，而使用慢病毒生产转基因鲤鱼还未见报道。因此，本发明期望获得转基因鲤鱼的慢病毒方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种基于慢病毒的转基因鲤鱼生产方法，该处理方法既能提高转基因的效率，又能降低转基因鲤的生产成本。

本发明为实现上述目的，采用如下技术方案：

制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法，其特征在于：首先构建所要转基因的慢病毒载体，其次，获得人工授精的鲤鱼未分裂的受精卵并进行脱粘处理；使用显微注射的方式进行慢病毒注射；

具体操作步骤为：

制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法，其特征在于按如下步骤实现：

（1）、根据鲤鱼IGF2b基因cDNA序列Genbank登录号为AF402958，设计引物：

IGF2b-BamHI-F，GATCATACGGATCCGCCACCATGGAGGACCAACTAAAACATCA

IGF2b-NheI-R，CAGTTGACGCTAGCTCATCGACTCTGTGCAAAAAGG；

扩增其CDS区

ATGGAGGACCAACTAAAACATCATTCTTTGTGCCATACTTGTTTGAGAACAGACAGTGTCATAAATAAGG

TCATAAAGATGTACTGGTCCATACGAATGCCCATATGCATACTGTTTTTAACCCTGTCTGCCTTCGAAGT

GGCTTCAGCTGAAACGTTATGCGGCGGAGAGCTGGTGGACGCGCTACAGTTTGTGTGTGGAGACAGAGGT

TTCTATTTCAGTCGACCAACTAGCAGGTTGAGCAGTCGACGTTCTCAAAATCGTGGGATTGTGGAAGAGT

GTTGTTTTAACAGTTGTAACCTAGCTCTTCTAGAACAGTACTGCGCTAAACCTGCCAAGTCAGAGAGGGA

CGTTTCAGCCACATCCCTACAGGTCATCCCGGTGATGCCCACATTAAAACAGGAGGTCCCAAGAAAACAT

GTGACCGTGAAATATTCCAAATACGACATGTGGCAACGAAAGGCCGCCCAGAGGCTACGGAGGGGCGTCC

CCGCCATCCTGCGGGCCAAGAAGTTTAGGCGGCAGGCGGAGAGAATCAGGGCCCAAGAGCAACTGCACCA

CCACAGGCCTCTCATCACGCTTCCCAGCAAGCTCCCGCCCATCCTTTTTGCACAGAGTCGATGA，

用Trizol（购自南京基天生物）抽提2个样品中的RNA，反转录成cDNA；PCR扩增条件优化：用Taq DNA polymerse(Fermentas)（购自上海英骏英骏生物技术有限公司）扩增目的片段，摸索PCR条件；以cDNA为模板，用高保真酶扩增目的片段，PCR体系如下：