[发明专利]产酸克雷伯氏菌的时间分辨荧光免疫检测法

说明书

技术领域

本发明涉及一种病原菌的检测，尤其是涉及一种产酸克雷伯氏菌的时间分辨荧光免疫检测法。

背景技术

产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)是重要的条件致病菌，可导致人畜患病，引起食物中毒等疾病(董捷，等.产酸克雷伯菌引起的食物中毒临床分析.中华传染病杂志.2002，20：315-316)。建立灵敏、特异、快速的检测技术，对产酸克雷伯氏菌进行监测，对疾病的早期预防能起到积极的指导作用。

由于产酸克雷伯氏菌具有不同的血清型，传统的细菌形态和生理生化特性检测方法并不能满足疾病防治的需要。分子生物学手段如定量PCR检测已开始在病原菌检测中得到应用，但是检测之前需要提取病原菌核酸，选取内标基因，设计和合成基因引物，样品的前处理复杂，过程控制严格，实验室依赖程度高，限制了其在实际中的应用。免疫检测技术方法简单、特异性强，在国内外病原菌检测中应用更为广泛，其中又以酶联免疫吸附法(ELISA)和荧光抗体法最为常用。ELISA是以酶为标记物，但酶为生物大分子，容易失活，不易保存，大分子的酶易对免疫反应造成空间位阻效应，同时该法必须通过显色进行信号测定。荧光抗体法是以荧光物质为标记物，这种标记物分子量小，稳定，标记到抗原或抗体后对免疫反应影响小，可以直接测量荧光信号，不需要显色，弥补了ELISA法的不足，但由于测量时的背景荧光波长与标记物相近，干扰样品测定，导致测定灵敏度不高。时间分辨荧光免疫检测(TRFIA)是用稀土离子螯合物作为标记物，该螯合物是一种长寿命的荧光物质，通过具有时间分辨功能的荧光仪可与短寿命的背景荧光分开，有效消除背景荧光的干扰，该法已在化学、医学、食品和环境等领域(Wu F B，et al.Synthesis of a highly fluorescent beta-diketone-europium chelate and its utility in time-resolved fluoroimmunoassay of serum total thyroxine.Anal Chem，2002，74：5882-5889)得到广泛关注，但对产酸克雷伯氏菌的检测从未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、简便快速的产酸克雷伯氏菌的时间分辨荧光免疫检测法。

所述产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca已于2011年07月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.5060。

本发明利用时间分辨荧光免疫检测(TRFIA)法进行产酸克雷伯氏菌的检测。

本发明包括以下步骤：

1)产酸克雷伯氏菌菌株的微生物学鉴定；

2)制备免抗产酸克雷伯氏菌抗体(IgG)；

3)IgG的Eu³⁺标记及纯化；

4)建立产酸克雷伯氏菌TRFIA检测方法

将产酸克雷伯氏菌菌株首先用无菌生理盐水洗涤，4500r/min，离心5min，弃上清；Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液稀释，取100μL加入到96孔微孔板中包被，用洗涤液冲洗，每孔加入200μL 1％的BSA，37℃封闭2h，洗涤，加入1∶320稀释的Eu³⁺-IgG溶液100μL，37℃振动孵育1h，用洗涤液冲洗，每孔加入200μL增强液，振荡，多标记分析仪上测量荧光读数CPS；设碳酸盐包被液作阴性对照，以样品孔的CPS值(P)与对照孔的CPS值(N)之比大于2(即P/N＞2)时判断为阳性。

在步骤1)中，所述产酸克雷伯氏菌菌株的微生物学鉴定的具体方法是：可采用Biolog自动生化鉴定系统(GeneIII)进行鉴定。

在步骤2)中，所述制备免抗产酸克雷伯氏菌抗体(IgG)的具体方法可包括以下步骤：

(1)将产酸克雷伯氏菌菌株接种于0.5％NaCl的牛肉膏蛋白胨培养液中，27℃培养24h，用甲醛及加热两种方法灭活，离心，再加入无菌生理盐水洗涤，调整细菌浓度至6×10⁸cfu/mL备用；