[发明专利]以大花香水月季茎段为外植体的植株再生方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种植株的再生方法，尤其是一种以大花香水月季单芽茎段为外植体，通过器官发生途径进行大花香水月季植株再生的方法，属于植物组织培养技术领域。

背景技术

大花香水月季（R.odorata var. gigantea）是蔷薇科（Rosaceae）蔷薇属（Rosa）落叶藤本，为单瓣花，乳白色，芳香，花径8～10cm。原产地是云南，是现代月季重要的原始亲本之一，是月季演化过程中的重要种源，也是培育大花品种和大型植株月季的种质资源。用传统的杂交育种方法选育新品种时，不仅周期长，工作量大，而且与其他野生种或品种杂交会出现不结实的问题；采用大花香水月季枝条扦插，则不会生根，而实生种子苗易发生变异，因此，繁殖很困难，制约着大花香水月季的繁殖及产业化发展。为了进行基因转化、诱变育种、快速繁殖和品种保存，必须建立植株的再生体系。目前，国内外还未见关于大花香水月季再生技术方面的报道。

发明内容

本发明针对大花香水月季存在的扦插不易生根、种子萌发率低、成活率低、实生苗后代易变异、难以通过外源基因进行遗传改良等问题，提出一种以大花香水月季单芽茎段为外植体，通过器官发生途径进行植株再生的方法，以解决大花香水月季快速繁殖的难题，为进行种质改良、资源保存以及新品种选育提供技术支持。

本发明通过下列技术方案实现：一种以大花香水月季茎段为外植体的植株再生方法，其特征在于经过下列各步骤：

A．选择腋芽饱满的大花香水月季中部枝条，并切成单芽茎段，经消毒处理后，接种在1.0～2.0mg/L 6-BA + 0.1～0.15 mg/L NAA + 6.2～7.0g/L琼脂 + 30g/L蔗糖，且pH值为5.8～6.1的MS基本培养基上，直至腋芽萌发后，再接种在1.0mg/L 6-BA + 0.01～0.02 mg/L NAA + 6.2～7.0g/L琼脂 + 30g/L蔗糖的MS基本培养基上，于23～26℃、光照强度2000～3000Lx，光照时间14h/d的条件下，进行继代培养25～35天，得到大花香水月季的无菌苗； 

B．将步骤A所得大花香水月季无菌苗的叶片切下，在小叶主脉处横切出伤口，叶背向下接种到下列愈伤诱导培养基上：MS基本培养基 + 5～9mg/L 2,4-D + 30g/L葡萄糖 + 2.5～3.0g/L植物凝胶，pH值为5.8～6.1，并在黑暗条件下培养，5～10天切口处膨大，可以观察到愈伤组织；

C．将步骤B所得愈伤组织接种到下列愈伤分化培养基上：MS基本培养基+1.0～5.0 mg/L TDZ + 1.0 mg/L GA₃ + 0.1mg/L NAA +0～1.0 mg/L 6-BA+ 30g/L葡萄糖 + 2.5～3.0g/L植物凝胶,pH值为5.8～6.1，并在黑暗条件下培养10～15天，之后在光照强度为2000～3000Lx，光照时间为14h/d条件下，培养10～15天，使愈伤组织分化出不定芽；

D．将步骤C得到的不定芽接种到下列壮苗培养基上：MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA +0.01～0.02mg/L NAA +0.3～0.5mg/L GA₃ +30g/L蔗糖+6.2～7.0g/L琼脂粉，pH值为6.0，培养至长出2～3cm高后，接种到下列生根培养基上：1/2MS基本培养基(大量元素减半)+ 0.1～0.3mg/L NAA +30g/L蔗糖+6.2～7.0g/L琼脂粉，pH值为5.8～6.1，并在光照强度为2000～3000Lx条件下，光照时间为14h/d条件下，进行生根培养，20～30天后即得植株。

所述步骤A的单芽茎段的消毒处理是：用0.1%升汞灭菌8～10min，再用无菌水冲洗干净，即可。

所述步骤B的愈伤诱导培养基中的2,4-D优选8mg/L。

所述步骤C的分化培养基中的TDZ优选3.0mg/L。

所述步骤C的分化培养基中的6-BA优选1.0 mg/L。

所述步骤D的壮苗培养基中的GA₃优选0.3mg/L。

所述步骤D的生根培养基中的NAA优选0.1mg/L。

为了便于对本发明的理解，发明人对上述各个步骤中所用的培养基、培养基中所用到的植物激素做了如下定义：

1、培养基包括：胚性愈伤诱导培养基、胚性愈伤分化培养基、壮苗培养基和生根培养基。