[发明专利]人脂联素ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学免疫学人脂联素单克隆抗体工程，并涉及人脂联素ELISA试剂盒的制备，以及试剂盒在检测人脂联素含量中的应用。

背景技术

脂联素(Adiponectin，APN)是由脂肪细胞合成和分泌的一种与细胞外基质相互作用的脂肪细胞因子，也称Acrp30、apM1、AdipoQ、GBP28。人类脂联素单体由244个氨基酸组成，包括有3个区域：氨基末端信号序列、胶原结构域和羧基末端的球形结构域(globular domain of APN，gAd)。脂联素以三聚体(65kDa)、六聚体(150kDa)和高分子量(HMW，18-36个单体，＞280kDa)聚合体三种亚型存在于血液中。

血清中脂联素的浓度范围在2～30μg/mL，占血浆蛋白总量的0.01％，无昼夜节律变化。交联反应和蔗糖梯度离心实验显示，高分子量寡聚体由2～6个三聚体脂联素聚合而成。电镜显示，三聚体呈球柄状结构，三个单体中的两个通过C端22位的胱氨酸(C22)形成的二硫键相连；六聚体则由两个相邻的三聚的球形结构域和一个单一的胶原柄组成。脂联素的球形结构域本身也可形成同源三聚体，但不能形成高分子量的寡聚体。

制备脂联素的方法包括：提纯、基因工程制备。其中基因工程是现在最常用的方法，基因工程制备脂联素又可以分为：大肠杆菌等原核细胞表达的重组脂联素、真核细胞表达的重组脂联素。真核表达的脂联素的功能分析揭示了糖基化修饰的脂联素作为胰岛素增敏剂的效应明显强于原核表达的非糖基化脂联素。这提示了脂联素的翻译后修饰对其发挥最佳的生物学活性是必不可少的。

脂联素的测定方法有多种，CN200480029098公开了：作为在各种多聚体混存的血液试样中测定脂联素总量的方法，有进行在十二烷基硫酸钠(SDS)的存在下煮沸，使各种多聚体中立体结构上隐藏的抗体的识别部位暴露出的处理之后，进行免疫学测定的方法(日本专利特开2000-304748公报)的报道。但是，该方法中存在需要用于煮沸(100℃)处理的装置、从煮沸处理到免疫学测定的两个工序实现自动化实际上是很困难的等问题。

血清中的存在HMW、六聚体及三聚体脂联素。CN200980106328公开了：免疫学性测定残留的脂联素，从而直接检测HMW脂联素含量、并间接将三聚体、六聚体部分各自分别测定的方法(WO2005/038457、Ebinuma H，et al.Clinica Chimica Acta.372：47-53，2006.)。

CN 200980106328为解决上述课题进行锐意研究的结果，发现了通过使各种蛋白酶中的糜蛋白酶作用于含多聚体脂联素的样品，在小鼠、大鼠等中也能选择性地消化HMW部分以外的脂联素，以及利用蛋白酶的消化处理之后，将残留的HMW脂联素进行免疫学性测定，就可以分级测定HMW脂联素。但是，这样的方法步骤复杂，操作不便，糜蛋白酶的成本高。

《排溢法ELISA，一种改进的二步法标记免疫实验技术》(《中国免疫学杂志》，2010年，第26卷)指出：

固相酶联免疫吸附实验(ELISA)的发展迄今已超过40年，其实验类型繁多，反应方式亦曾历多次重要改进。通常情况下，排溢法检测所用标记抗体溶液的密度与粘度越高，分层维持的时间越长，分层界限越清晰。然而过高的密度与粘度对标记抗体在溶液中的弥散及其免疫结合会带来一定程度的负面影响。为达到理想的实验结果，在标记抗体稀释液的配制过程中，通过加入几种经优化选择的高、低分子溶质提升稀释液的密度；通过改变此两类化剂的比例调节稀释液的粘度；在某些特殊(密度与粘度要求较高)的实验场合，尚需适当延长反应时间，或加入适量免疫活性剂以促进标记抗体与固相化抗原的结合。鉴于在不同实验体系中标记抗体稀释液的制备须经历一个较具个性化的，复杂而细致的优化过程，其具体配制方法我们将在有关研究中作进一步的阐述。

而目前用于检查脂联素抗体的ELISA方法的缺点是血清中所含的高浓度的非特异性抗体可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面，从而导致本底较高或者可能出现假阳性的结果。克服ELISA的假阳性和较高本底，使得反应更加均匀，一直是科研的热点。

目前，常用脂联素单克隆抗体、脂联素ELISA试剂盒均购自美国R&D Systems公司。脂联素ELISA试剂盒价格昂贵、操作时间长、不利于大规模检测人脂联素含量。因此，如何研制步骤简单，操作方便的脂联素测定方法是本发明所要解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种基于双抗体夹心原理研制的检测人脂联素含量的ELISA试剂盒。