[发明专利]一种针对人TNF-α分子的自体疫苗的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及基因克隆、基因重组、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白的纯化等技术领域，进一步涉及一种在体内能够诱导出针对人TNF-α分子自身抗体的蛋白疫苗的构建方法。 

背景技术

1.TNF-α分子及抗TNF-α治疗的相关研究 

1.1TNF-α分子 

1975年Carswell等发现，卡介苗和细菌内毒素感染的小鼠血清中有一种高活性的肿瘤细胞毒因子，可使肿瘤发生出血性坏死，但对正常组织细胞无杀伤活性，将其命名为肿瘤坏死因子——TNF-α。人TNF-α基因位于6号染色体，基因长4kb，含4个外显子，与MHC基因连锁，其前体由232个氨基酸组成，含有76个氨基酸的信号肽。小鼠基因位于17号染色体，由4个外显子和3个内含子组成，前体由235个氨基酸组成。人和小鼠TNF-α前体有79％同源性，成熟型人TNF-α由157个氨基酸组成，分子量约为17KDa，较小鼠成熟型TNF在73位多一个组氨酸残基。人和小鼠的成熟型TNF-α均含有两个半胱氨酸(人69、101位；鼠69、100位)，可以形成分子内二硫键。从细胞株培养上清中分离纯化的TNF-α在非还原条件下分子量大小不等，在还原条件下分子量为17KDa，与理论分子量一致。这可能是因为TNF-α以不同程度的聚合体形式存在的原因。目前已证实TNF-α活性形式是由17KDa的亚基组成的同源三聚体。 

TNF-α是一种多功能的细胞因子。它除了能在体内、外杀伤肿瘤细胞外，还具有诱导炎症反应、抗病毒感染、调节机体免疫、促进细胞增殖和活化等多种功能。TNF-α对肿瘤具有直接抑制和细胞溶解作用，但不同肿瘤株对TNF-α的敏感性不同。TNF-α抗肿瘤机制不完全清楚，目前的研究结果表明TNF-α抗肿瘤的机制主要有： 

(1)通过与肿瘤细胞TNF-α的表面受体结合而发挥细胞毒作用。目前已知的受体有两种，TNFR I和TNFR II，均为跨膜糖蛋白。TNFR I通过其胞浆区的约80个氨基酸残基的死亡区结构域(death domain，DD)介导肿瘤细胞的凋亡。 

(2)通过对血管内皮细胞的作用，诱导凝血因子的表达，增加纤溶酶原抑制剂的分泌，从而促进血管内凝血及血栓的形成，造成肿瘤组织的局部缺血而坏死。 

(3)通过介导杀瘤效应细胞的作用和诱导肿瘤局部的炎症反应，促进杀瘤效应细胞的作用。 

在抗病毒方面，TNF-α可以选择性的杀伤病毒感染的细胞，并对不同的病毒感染具有不同的作用。如对VSV、HSV等病毒具有抑制作用，但是对HIV具有促进作用。另外，TNF-α是重要的炎症因子，一方面它可以刺激内皮细胞表达MHC I类抗原和多种黏附分子的表达，促进IL-1、IL-6的表达，刺激内皮细胞和白细胞释放一系列炎症介质。另一方面TNF-α可促进中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞黏附在内皮细胞上，从而参与炎症反应。TNF-α还能够促进T、B细胞增殖，促进抗体产生；活化单核巨噬细胞，提高其杀伤活性；上调巨噬细胞MHC II类分子，提高抗原呈递能力等。 

1.2抗TNF-α治疗 

研究发现，TNF-α在体内持续、高水平的表达时在多种疾病中发挥重要的作用，如：恶液质、胰岛素抵抗、感染性休克、炎症反应、自身免疫性疾病等。研制TNF-α拮抗药物为治疗TNF-α水平增高相关疾病提供了一条好的途径。 

传统的用于治疗体内TNF-α的过量表达相关疾病的药物主要有：非甾类抗炎药(NSAIDS)，缓解疾病的抗风湿药物(DMARD)，皮质甾类、免疫抑制剂和止痛剂。近年来相继问世的新药有：氨甲喋呤、来氟米特等。但上述药物均具有较明显的毒副作用。 

目前研究主要集中于TNF-α拮抗生物制剂，其疗效显著、副作用小。