[发明专利]人甲状旁腺激素1-34的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，涉及一种基因工程方法构建人甲状旁腺激素(1-34)重组工程菌，进而发酵、纯化制备人甲状旁腺激素(1-34)的方法。

背景技术

人甲状旁腺素（human parathyroid hormone，称hPTH）是由人甲状旁腺分泌的活性多肽，其主要生理功能是通过调节骨细胞和肾细胞维持血钙平衡，是调节钙磷代谢的重要肽类激素，调节骨吸收和骨合成的速率，影响骨代谢。甲状旁腺激素能高效、选择性地增加成骨细胞的活性及数量而促进骨生长。它不仅可预防雌激素水平下降而导致的骨量丢失，且能逆转骨量丢失，从而可达到治疗骨质疏松的目的。

天然人PTH含有84个氨基酸，简称PTH(1-84)，分子量在9400左右。PTH的氨基端是其活性端，与靶组织受体结合引起生物学效应，只要有PTH氨基端的 1-34个氨基酸片段即有完全的PTH(1-84)活性。人工合成的PTH(1-34)动物和临床试验结果显示其能使骨质疏松的成年大鼠全身钙和骨骼质量增加。 

PTH(1-34)的制备主要有化学合成法和基因工程法，其中化学合成 PTH(1-34)成本高、价格昂贵，而且对环境造成有害的影响，不利于大规模生产。用基因重组技术生产的人 PTH(1-34)是解决这个问题的有效途径, 通常将编码PTH的基因克隆到大肠杆菌中，通过大规模发酵基因工程大肠杆菌来大量表达目标蛋白，进而通过分离纯化，得到符合要求的PTH。尽管大肠杆菌表达系统具有稳定性好、易于基因操作及表达量高等优点，这一表达系统也存在缺点。其中一个明显的缺点是大肠杆菌缺乏合适的蛋白质分泌机制，这使得绝大多数在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白只能在胞内积累。外源蛋白在胞内滞留会影响到其继续合成、容易遭受胞内蛋白酶的攻击、也导致后续的分离纯化变得困难。另外，多肽因其分子小，直接表达存在困难，一般需要采用融合表达技术。目前研究采用的融合表达分为自身串联融合表达和与其它载体蛋白融合表达两种，大都在胞内积累，易形成包涵体，而从包涵体复性具有生物活性的蛋白，需要经过一系列的变性复性过程，其代价是非常昂贵的。如何经济有效地利用大肠杆菌来生产小分子量多肽一直是一个难题。

发明内容

本发明的目的是为解决上述技术问题，提供一种人甲状旁腺激素(1-34)的制备方法。

本发明的上述技术目的具体是通过以下技术方案得以实现的：

人甲状旁腺激素(1-34)的制备方法，包括以下步骤：

①设计并合成PTH（1-34）的基因序列，具体序列如下，GGTACCGACGACGACGACAAATCTGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCATAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAGAAACTGCAGGATGTTCACAACTTCTAAGCTT；

②将合成的基因序列用KpnI和HindIII酶切，装载于同样酶切的载体pET32a上，用DNA连接酶连接后，转化大肠杆菌，得到大肠杆菌转化子，抽提该大肠杆菌转化子的质粒，然后构建完成表达载体pET32a-PTH；

③将上述表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3），得到基因工程菌；

④对该基因工程菌进行发酵，发酵过程中加入IPTG和曲拉通X-100；

⑤利用融合蛋白耐高温的特性，将发酵液加热处理，然后离心除去杂蛋白，初步纯化并浓缩目的蛋白；

⑥将浓缩后的目的蛋白加入缓冲液，过层析柱，使得含有6×His标签的融合蛋白得以进一步浓缩，除去杂蛋白，得到高纯度的融合蛋白；

⑦在合适的酶切条件下，利用肠激酶酶切高纯度的融合蛋白，使得融合标签和人甲状旁腺激素（1-34）断裂。

作为上述技术方案的优选，它还包括以下步骤：

⑧经肠激酶酶切后的蛋白，配制成溶液后再过层析柱，使得融合标签与树脂结合，目标产物富集于穿透液中；

⑨收集上述穿透液，过凝胶层析柱，除去残留的肠激酶及其它残留杂蛋白，收集目标产物;

⑩将上述溶液冻干，得到纯的多肽产品。

作为上述技术方案的优选，步骤④中曲拉通X-100的加入量为0.1%(m/V)。

作为上述技术方案的优选，步骤⑥所述中层析柱为Ni²⁺亲和层析柱。

作为上述技术方案的优选，步骤⑧所述中层析柱为Ni²⁺亲和层析柱。

本发明具有以下有益效果：