[发明专利]一种土拉弗朗西斯菌检测试纸及其制备方法、利用该检测试纸的检测方法和定量检测系统

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及土拉弗朗西斯菌的快速定性和定量检测方法以及胶体金免疫检测试纸条。 

背景技术

土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis，Tula)简称土拉菌，该菌能引起“土拉热”的人畜共患病，感染者会出现皮肤溃烂、淋巴腺肿大、肺部感染和伤寒样症状，病情严重甚至死亡。该菌具有分布广泛，传播途径多样，感染剂量低、致病性强等特点。注射10cfu、与皮肤接触10-50cfu、或摄入10²-10⁸cfu该细菌都能导致土拉菌病感染。因此该细菌被列为与鼠疫、炭疽等同列的A类恐怖源，已引起全世界的高度重视。《禁止化学武器公约》也将土拉热也被列为最为严格的控制对象。 

生物安全问题已引起全球关注，美国疾病预防控制中心将土拉菌列为最有可能用于生物武器的病原体。从国家生物安全战略高度看，我国境内，尤其是出入境口岸应加强对土拉菌的反生物恐怖的研究。反生物恐怖的首要任务是迅速作出诊断，明确病原，以便及时正确救治病人，减少继发性传播，迅速有效地控制和防治疫情的蔓延。胶体金标记的免疫层析方法具有快速、简便、不需要依赖重要装备、能够实现现场检测等特点，成为目前传染病快速诊断中研究的热点。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种土拉弗朗西斯菌检测试纸及其制备方法、利用上述检测试纸快捷检测土拉弗朗西斯菌的方法、和利用上述检测试纸定量检测土拉弗朗西斯菌的检测系统。 

为实现上述目的，本发明一种土拉弗朗西斯菌检测试纸，包括反应支撑物、紧密连接于反应支撑物上表面中部的硝酸纤维膜，硝酸纤维膜起始端的上表面与吸水垫部分重叠连接、硝酸纤维膜末端的上表面与含有胶体金标记的FopA-S多克隆抗体的金标抗体保护膜部分重叠连接，金标抗体保护膜的上表面部分重叠连接有样品垫，其中，硝酸纤维膜上靠近其起始端处设置有质控抗体包被的质控条带、靠近其末端处设置有兔 抗重组FopA-L多克隆抗体检测条带。 

进一步，所述反应支持物为PCV板，吸水垫为滤油纸。 

进一步，所述金标抗体保护膜为玻璃纤维膜、聚脂膜或滤纸纤维。 

进一步，所述样品垫为玻璃纤维膜、聚脂膜或滤纸纤维，其采用含有吐温20的磷酸盐缓冲液进行预处理。 

进一步，所述质控抗体根据金标抗体的免疫源选择为抗兔IgG或者SPA，其优选为羊抗兔IgG。 

进一步，所述试纸整体的外部包裹有外壳，该外壳上对应于所述样品垫处设置有样品孔，外壳上对应于所述质控条带、检测条带处设置有观察窗。 

一种上述土拉弗朗西斯菌检测试纸的制备方法，具体为： 

1)制备胶体金：配制浓度为0.01％的HAuCl4水溶液，并调整其pH值为6-8，用PBS稀释抗体至浓度为0.2mg/ml； 

2)制备金标抗体保护膜：取步骤1)中制备的胶体金以1ml/管分装于若干个1.5ml的离心管中，每支管中抗体量为2-10ug，轻摇混匀后放置；每管中加入10％的BSA100ul，混匀放置；将上面初步制得的胶体金探针进行第一步离心处理，弃上清液；每支离心管中加入1ml重悬液悬浮沉淀后进行第二步离心处理；弃上清液，管底得到暗红色的疏松状沉淀，加入500ul重悬液重悬后进行第三步离心处理，取上清液，均匀滴加在金标抗体保护膜的膜体上，并干燥处理； 

3)喷涂硝酸纤维膜：在膜体上喷涂羊抗兔IgG包被的质控条带、兔抗重组FopA-L多克隆抗体检测条带，再将胶体金标记的FopA-S多克隆抗体均匀涂布在膜体上； 

4)将反应支撑物、硝酸纤维膜、吸水垫、金标抗体保护膜和样品垫按照试纸结构形式进行组装来制备检测试纸。 

进一步，所述步骤1)中的具体步骤为：磁力搅拌下准确加入1ml 1％的HAuCl4，同时加入1.5-3ml 1％的柠檬酸三钠水溶液，颜色稳定后继续加热，冷却至室温后加纯水至100ml，4℃避光保存；用K₂CO₃调PH值最优为7.0-7.5后，用PBS稀释抗体至0.2mg/ml，并保持胶体金稳定。 

进一步，所述步骤2)中所述第一步离心处理中在12000rpm、4℃下离心30分钟，所述第二步离心处理在12000rpm、4℃下离心30分钟，第三步离心处理在1000rpm、4℃下离心10分钟。