[发明专利]一种具有多价效应和纳米尺寸效应的多肽荧光探针的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物分子领域。

背景技术

自1992年绿色荧光蛋白(GFP)的cDNA序列被克隆以来，基于GFP的标记技术迅速发展。随着GFP晶体结构的解析，荧光蛋白突变导致理化特性改变的研究，以及新荧光蛋白物种的发现，荧光蛋白及其突变体作为报告分子或功能探针已被广泛地用于生命科学的研究中，例如基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物等。

基于荧光蛋白的分子标记技术，具有生物相容性好、可用于长时程动态监测、以及活细胞内精确空间定位的特点，在活体和活细胞水平的生物分子动态研究中发挥了重要作用。尤其是源自珊瑚虫的红色荧光蛋白(dRFP583)的发现，以及在此蛋白基础上突变获得的一批成熟更快、荧光强度更强、光谱红移的红色荧光蛋白和远红色荧光蛋白，如TagRFP、mKate、Katushka、mLumin等，极大地促进了荧光蛋白标记技术在活体分子成像研究中的应用。

然而，橙色、红色和远红色荧光蛋白(发射峰大于550nm)通常是以二聚体或四聚体的形式存在。对于生物分子(如蛋白质、离子、核酸分子等)功能研究而言，荧光蛋白的多聚化很容易造成以荧光蛋白作为标签的目标蛋白非特异性地聚集，或影响其所标记蛋白质的理化性质，从而导致检测的光学信号不能真实地反映生物分子信息。因此，可发生多聚化的荧光蛋白不适合作为荧光标记物用于目标蛋白的运动、定位及相互作用研究。现阶段针对荧光蛋白标记技术的研究热点之一，是如何获得理化特性好的荧光蛋白单体。而对如何将荧光蛋白突变体的多聚化性质应用于生物学研究中，关注较少，仅限于对活细胞的示踪。

靶向性多肽(targeting peptide，简称TP)的鉴定通常是使用化学小分子染料对多肽进行标记，例如，用FITC标记多肽进行细胞水平的光学成像鉴定，或Cy5.5标记多肽在活动物体内进行光学成像鉴定。以荧光蛋白作为靶向性多肽的报告分子，用于活细胞表面的检测或多肽特异性的鉴定，虽有报道，但并非主流方法。其原因在于，与荧光染料标记方法相比，荧光蛋白偶联的多肽探针检测灵敏度较低，且仅限于活细胞水平的研究应用，尚未见到用于活体分子成像的报道。

研究表明，细胞表面受体介导的内吞作用，其内吞效率与配体的效价密切相关。针对受体介导内吞的这种特性，将靶向肽与纳米载体进行共价偶联，适当增加纳米载体表面偶联的靶向肽数目，由此产生的多价性质使得受体介导纳米载体内吞的效率显著提高。目前尚无文献报道利用荧光蛋白的多聚化特性形成具有多价效应的多肽荧光探针。

在根据多价效应进行信号放大的方法中，生物素和亲合素(ABC法)或链霉素和亲和素(SP法)的标记方法应用最为广泛。但是ABC法和SP法都不适应于内源性生物素含量较高的组织如肝脏、肾脏和脾脏，因此存在一定的局限性。

发明内容

本发明的目的是建立一种构建多肽荧光探针的方法，此探针具有多价效应、纳米尺寸效应和广泛生物组织适用性，可高灵敏度地用于活细胞表面标志物的检测或多肽特异性的活体鉴定。

本发明所采用的技术方案是：

一种具有多价效应和纳米尺寸效应的多肽荧光探针的构建方法，该构建方法是利用基因重组技术，将靶向肽序列同时融合到荧光蛋白的氨基端和羧基端，或分别融合到荧光蛋白的氨基端或羧基端，构建成多肽荧光探针；所述荧光蛋白能发生四聚化。

进一步地，所述多肽荧光探针具有多价效应和纳米尺寸效应。

一种具有多价效应和纳米尺寸效应的多肽荧光探针的应用，所述多肽荧光探针可用于灵敏地检测活细胞表面标志物。

一种具有多价效应和纳米尺寸效应的多肽荧光探针的应用，所述多肽荧光探针可用于多肽特异性的活体鉴定。

本发明具有以下优点：