[发明专利]一种适用于炭疽抗毒素和疫苗的融合蛋白

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种适用于炭疽抗毒素和疫苗的融合蛋白的制备。

发明背景

炭疽病(Anthrax)是由革兰氏阳性的炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)引起的人、 家畜和野生动物共患的一种急性、热性、败血性传染病，在农牧业上造成巨大的经济损失。 此外，炭疽杆菌产生的芽胞具有很强的耐高温，抗消毒剂，抗辐射，不易清除的特性。这一 特点使得炭疽杆菌成为传统生物武器和生物恐怖袭击的首先材料。因此，世界各国尤其是欧 美发达国家近几年都加速了炭疽药物或者疫苗的开发。

炭疽病的致病因子主要包括由内生质粒pOX-1编码的细菌荚膜和由质粒pOX-2编码的外 毒素。前者的组成为带负电荷的多聚D谷氨酸，它能够抵御吞噬细胞的吞噬作用以及血清中 的阳离子的降解，从而使菌体细胞能够在体能大量繁殖。后者是炭疽芽胞杆菌主要的致病 因子，由保护性抗原(PA，83KDa)，致死因子(LF，90KDa)和水肿因子构成(EF，89KDa) 构成的AB型外毒素。A PA主要作用是与细胞表面特定的受体结合，并转运LF和EF进入细胞。 LF是有776个氨基酸残基构成的锌离子依赖型的金属蛋白酶，能够特异性结合并且切割有丝 分裂蛋白激激酶家族(MAPPK)的N端，如MEK1，MEK2，MKK3，MKK4，MKK6，和MKK7。MAPKK 的切割进一步阻断了包括细胞外信号调节激酶(ERK)，p38和JNK等细胞信号转导途径，进 而导致细胞裂解(Duesbery and Vande Woude 1999；Vitale，Blanset et al.2006)。EF是 由767个氨基酸组成的一种依赖与钙离子的腺苷酸环化酶，能够催化细胞内的ATP转化为 cAMP(Collier and Young 2003)，使得细胞内外水份失衡进而导致水肿。在致病时，炭疽 毒素的单一成分不能发挥作用，水肿因子或致死因子必须与保护性抗原结合成水肿毒素 (EF+PA，EdTx)或致死毒素(LF+PA，LeTx)才具有致病作用。炭疽毒素致病的过程为： 保护性抗原与细胞表面的受体肿瘤内皮标志物8(TEM-8)或毛细管形态生成蛋白2(CMG-2) 结合(Bradley，Mogridge et al.2001；Scobie，Rainey et al.2003)后，被细胞表面弗 林类酶特异性地切割后释放出氨基酸20千道尔顿(PA20)的多肽片段，剩下的结合于受体的 63千道尔顿(PA63)形成一个七聚体，该七聚体自发地结合LF或EF或同时结合LF和EF，形成 一个多聚体复合物。该复合物在细胞表面辅助受体LPR6的协助下，内吞入胞内。内吞体在 胞内酸性环境的诱导下，PA63发生构象重排，插入到内吞体膜中，形成一个通道。此时，结 合于七聚体的EF或者LF在离子梯度和跨膜正电势差的作用下被拉入孔道，进入受体细胞，进 而发挥致病作用(Young and Collier 2007)。

目前针对炭疽病治疗的药物主要是抗生素和保护性抗原特异性的抗血清。前者主要包 括青霉素，四环素，链霉素，脱氧土霉素，乙酰红霉素，环丙沙星等，后者主要是来源于志 愿者的血清。这些传统的药物和治疗手段存在诸多的缺陷：第一抗生素治疗只能杀掉体内感 染的炭疽芽胞杆菌菌体，而对于存在巨大潜在危害的芽胞却无能力；第二，对于感染后期的 人，因大量的外毒素已经分泌到血液中，抗生素并不能将其清除；第三，因为目前大量的抗 生素的使用导致病原菌都出现了很强的耐药性；第四，对于治疗炭疽病，这些抗生素都需要 很大的剂量，并不适用于那些对抗生素过敏的特殊人群。而抗血清治疗虽然能够清除分泌到 血液中的炭疽外毒素，但也存在譬如血清来源有限，患者注射后出现过敏反应等诸多问题。 因此开发新型高效安全的炭疽病治疗药物已成为全球面临的挑战和各个国家研究的热点 (Baillie 2006)。