[发明专利]基因改造和RNAi的基础上利用植物隐性基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因改造和RNAi的基础上利用植物隐性基因的方法。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是一项基因沉默新技术，自20世纪90年代被发现以来，已被广泛应用到动植物功能基因组研究及医学研究当中，现在已逐渐成为分子生物学和细胞生物学研究的有用工具之一。

基因工程育种是分子育种的重要内容，也是未来育种的趋势。基因工程中利用大都是显性抗病基因，至今尚未有通过基因工程手段利用隐性抗病基因仅改变植物抗性但不影响植物其它农艺性状的报道。这是由于在植物转基因过程中很少发生同源重组，因此通过基因工程手段将来源于植物的隐性抗病基因导入植物后，在转基因植株中由于显性基因的存在而不能获得抗病效果，另外大多数隐性抗病基因不仅参与了抗病，还在植物的生长发育过程起着重要的作用，Chu等通过RNAi(RNAInterference)的方法验证水稻白叶枯病隐性xa13基因的功能时发现，转基因水稻的产量随着xa13表达量的降低而减少，水稻基因xa5编码一个基本转录因子TFIIAγ的隐性抗病基因，通过RNAi方法抑制与xa5等位的显性感病基因Xa5的表达，可能影响水稻的生长发育和产量。因此，一种能通过基因工程手段利用隐性抗病基因只改良水稻抗性，不影响水稻其他农艺性状的方法不仅具有重要的理论意义，也为改良水稻抗性提供更多可利用的抗源和途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种基因改造和RNAi的基础上利用植物隐性基因的方法。

本发明在基因改造和RNAi的基础上利用植物隐性基因的方法是通过构建培育抗病植物的DNA分子来实现的。

所述培育抗病植物的DNA分子包括RNA干扰表达盒和人工改造基因表达盒，所述RNA干扰表达盒自上游至下游依次包括启动子、表达发卡RNA的DNA分子和终止子，所述表达发卡RNA的DNA分子由A、B和C三个片段依次连接组成，所述A片段选自目的蛋白的编码基因的至少277bp，所述C片段与A片段反向互补；所述人工改造基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、人工改造的目的基因和终止子，所述人工改造的目的基因编码所述目的蛋白，并且没有与A或C片段的任一段连续19bp的互补区。

其中，所述RNA干扰表达盒和所述人工改造基因表达盒的转录方向最好相反。

启动子和终止子没有特别的要求，能在真核生物中具有启动外源基因表达的启动子均可，当然如果针对单子叶植物可优先选择玉米泛素(ubiquitin)基因的启动子。

上述目的蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列4。针对该目的蛋白，所述A片段的核苷酸序列具体可为序列表中的序列1，所述人工改造的目的基因为序列表中的序列2。

所述B片段没有特别的限制，可以选择多种植物基因的内含子，如Race intron，其核苷酸序列为序列表中的序列3。

含有所述DNA分子的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体可为在植物表达载体的多克隆位点插入所述的DNA分子。

所述的DNA分子和所述的重组表达载体可用来培育抗病植物。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗病植物的方法。

本发明所提供的培育抗病植物的方法，是将所述的DNA分子导入植物中获得抗病植物。

其中，所述植物可为水稻，所述抗病植物可为抗白叶枯菌的水稻。

本发明的培育抗病植物的DNA分子可构建到植物表达载体中导入植物中，获得抗病的植物。将本发明的培育抗病植物的DNA分子转入水稻台北309中，获得的转基因株系，在成株期对白叶枯菌株P1具有高度抗性，同时其结实率不会受到影响，说明利用本发明的DNA分子培育能调控水稻隐性基因xa5，改良水稻白叶枯的抗性，同时不影响水稻其他农艺性状的，获得抗白叶枯菌且高产的水稻新品种，对农业生产具有重要意义。

附图说明

图1为pXa5^RNAi-xa5^M载体图谱。

图2为转pXa5^RNAi-xa5^M载体水稻的分子检测。

图3为转pXa5^RNAi-xa5^M载体水稻抗白叶枯菌。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

一、转基因载体的构建

1)显性Xa5 RNAi片段序列的获得