[发明专利]猪α干扰素/白细胞介素2嵌合基因、其构建及其蛋白纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及猪α干扰素与白细胞介素2嵌合基因构建及其融合表达，纯化技术，还涉一种柔性基因接头(linker)。

背景技术

我国是世界上养猪大国，猪的疾病种类繁多，特别是病毒性传染病造成的发病率和死亡率最高，每年给养猪业造成巨大的经济损失。对养猪业危害较为严重的病毒主要有：猪瘟、猪繁殖与呼吸综合症、猪圆环病毒II型、猪流感、猪细小病毒、猪口蹄疫、猪伪狂犬病、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻等病毒。其中前5种病毒是造成呼吸道综合症、猪免疫抑制病和繁殖障碍综合症的主要病源，其流行范围广泛、危害养猪业最为严重；有些病毒性疾病(如口蹄疫、猪流感等)还威胁到人类自身的健康。2006年下半年至今，在全国大部分省区造成养猪业巨大损失的高致病性猪蓝耳病已给我国养猪业造成巨大经济损失。因此对这些病毒性疾病的治疗和预防成为养猪业的首要任务。

干扰素(interferon，IFN)是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫激活功能活性的细胞因子。哺乳动物的干扰素分为I型和II型两大类，IFN-α属于I型干扰素，主要作用是抑制病毒繁殖、抗肿瘤活性作用、加强NK细胞杀伤病毒感染细胞的能力从而抑制病毒的增殖和扩散、增强机体细胞免疫应答水平等。由于IFN-α广谱的抗病毒活性，目前人用基因工程重组IFN-α制剂(rIFN-α)已作为抗病毒生物制剂而广泛应用于临床。

白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)又称T细胞生长因子，能诱导T淋巴细胞增殖，增强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活性，刺激细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF-α)、IFN-γ等细胞因子，促进机体的细胞免疫能力；同时也能激活B淋巴细胞，参与机体的体液免疫应答，促进抗体分泌；IL-2还可增强巨噬细胞对抗原递呈能力、杀菌力及细胞毒性，从而发挥其抗病毒和抗肿瘤作用。因而，基因工程重组IL-2蛋白(rIL-2)制剂不仅可作为抗病毒性疾病、自身免疫病与防治肿瘤方面的治疗药剂，而且还可作为佐剂增强疫苗的免疫效果，具有广阔的应用前景。

正常情况下，IFN-α、IL-2等细胞因子在动物体内的表达量较低且难以提取应用，已有的采用体外抗原刺激动物白细胞使其产生IFN-α的方法得到的产品产量和活性都低，且生产成本较高。基因工程α干扰素及IL-2具有广谱的抗病毒活性和增强疫苗免疫力作用，对细胞内寄生菌和寄生虫等的增殖和活性也有一定的作用，而且不会产生耐药性和残留，不会对人类健康造成危害，因此一直是研究抗病毒制剂关注的焦点。研究表明原核表达的基因工程重组猪α干扰素(rPoIFN-α)蛋白和重组猪白细胞介素-2(rPoIL-2)蛋白均具有抗病毒活性，rPoIL-2还具有增强机体细胞免疫的能力迄今为至，国内外尚无猪α干扰素与白细胞介素2嵌合基因的构建、融合表达及纯化等方面研究的相似或相同报道，更没有商品化的基因工程重组猪α干扰素/白细胞介素2融合蛋白(rPoIFN-α-linker-PoIL-2)可以应用。

发明内容

本发明目的在于提供一种猪α干扰素/白细胞介素2嵌合基因，另一目的在于提供其构建、表达及其蛋白纯化的方法，以得到抗病毒谱广、抗病毒活性高、生产成本低、易于生产、无残留、不会使病原体产生耐药性、具有PoIFN-α和PoIL-2抗病毒功能叠加的高效基因工程复合抗病毒制剂，用于猪病毒性疾病的防治。

为实现本发明目的，本研究采用重叠延伸PCR(splicing by overlapextension-PCR，SOE-PCR)方法将PoIFN-α和PoIL-2成熟肽基因通过一个基因柔性接头(linker)(G₄S)₃构建成PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因，将嵌合基因连接入pQE30原核表达载体进行融合表达，采用尿素溶解-低浓度蛋白复性液复性-PBS透析方法对融合蛋白进行复性和纯化。主要内容如下：

1、猪α干扰素/白细胞介素2嵌合基因、其构建及其蛋白纯化

1.1引物序列

共设计4条引物用于SOE-PCR的扩增，P1/P2引物对分别为扩增PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因的PoIFN-α-linker部分所用上/下游引物；P3/P4引物对分别为扩增PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因的linker+PoIL2部分所用上/下游引物。引物核苷酸序列如下：

P1：tcagcatgct gtgacctgcc tcagaccc 28