[发明专利]超顺磁性纳米颗粒原位吸附分离-固定化红球菌生物脱硫工艺

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种利用超顺磁性纳米颗粒原位吸附分离-固定化细胞进行微生物油品脱硫的工艺。

背景技术

石油及其产品中的含硫化合物对石油加工及其产品应用带来了许多危害，如含硫燃料燃烧后产生的SOx等会严重污染环境并造成酸雨；造成石油炼制时催化剂中毒；腐蚀贮运设备等。国际上对燃料油的硫含量要求越来越严格。随着环保要求的日益严格，汽油、柴油质量总的发展趋势是低硫甚至是无硫(硫含量小于10～15μg·g^-1)，实现车用燃料清洁化。

正在兴起的生物催化脱硫技术(Biodesulfurization，BDS)，以其具有的选择性高，副反应少，反应条件温和，投资少，对燃料热值影响小，能脱除加氢脱硫难以处理的二苯并噻吩(DBT)及其衍生物等优点(参见文献1：McFarland，B.L，Curr.Opin.Microbiol.，1999，2：257-264；文献2：Monticello，D.J.，Chemtech.，1998，28：38-45)，逐渐成为令人瞩目的清洁燃料生产技术，有望成为传统加氢脱硫(Hydrodesulfurization，HDS)过程的辅助途径来进行含硫燃料的精加工(文献3：Kilbane，J.J.，Curr.Opin.Biotechnol.，2006，17：305-314)。其中，红球菌是最具代表性的生物脱硫菌株，由于其代谢底物的多样性被广泛用于生物转化、生物降解等方面，具有广阔的工业应用前景。

油品的微生物脱硫是一个复杂的生物反应过程，涉及水相、油相和生物催化剂固相组成的多相体系；从微生物脱除DBT中硫的代谢途径及代谢机理可知，生物脱硫是一个多酶反应过程，并且需要辅因子的参与(文献4：Gray，K.A.；etal，Nat.Biotechnol.，1996，14：1705-1709)。因此，脱硫反应存在两相混合、含硫化合物传递、反应后的两相分离、生物催化剂的分离回收等问题。Monot，F.等发表的美国专利USP 6,337,204 B1认为BDS包括五个操作单元：细菌发酵罐培养→脱硫生物催化剂的准备→生物脱硫→油水相分离→消除硫酸盐。其中，生物催化剂可以是细菌直接培养液或使用过滤、离心等方法分离收集菌体后，配制成静息细胞(resting cell)或固定化细胞。根据脱硫菌的游离状态可分为游离细胞生物脱硫工艺和固定化细胞生物脱硫工艺。

生物脱硫研究最多的是游离细胞生物脱硫，其特点是脱硫速率快，但存在严重缺点：油/水/生物催化剂乳化严重，并且游离细胞很难重复利用。而固定化细胞能够较好地避免这些缺点，细胞固定化是很有希望的措施之一。细胞固定化可以增加微生物对有机溶剂的耐受能力；简化油品及生物催化剂的回收；生物催化剂可重复使用，从而可降低生物催化剂的生产成本。目前，有关生物脱硫固定化的方法主要有：海藻酸盐、光交联树脂预聚体(ENT-4000)、聚乙烯醇(PVA)等包埋方法；或以硅藻土为吸附载体固定脱硫菌。包埋固定化方法细胞一般需要首先从发酵液中离心收集细胞，另外由于传质阻力的存在，脱硫活性较低；而吸附法由于结合力弱，往往容易流失细胞。本实验室单国彬等通过在载体中添加磁性Fe₃O₄纳米颗粒，使用液氮冷冻-解冻法制备了磁性PVA固定化德氏假单胞菌R-8细胞(单国彬等.CN1616604)；该方法虽然结合了磁性载体和固定化技术的优势，但仍需要首先从发酵液中离心收集细胞，并且使用液氮多次冷冻解冻PVA载体，操作相对繁琐。因此，迫切需要开发一种能够直接从细菌发酵液中分离固定化细胞，且保持细胞高脱硫活性的方法，以实现生物脱硫技术工业化要求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有生物脱硫“游离细胞重复利用困难，而固定化细胞步骤繁琐且存在传质阻力”的缺点，提出了“细胞表面自组装”实现细胞原位吸附-固定化生物脱硫的新设想，通过在细胞表面吸附超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒，脱硫微生物细胞能够从其发酵液中原位磁分离并固定化，大大简化了细胞分离和固定化的步骤；磁性纳米颗粒原位吸附分离-固定化细胞的脱硫活性高，达到与游离细胞相近的脱硫速度，并具有重复使用的优点，克服了游离细胞生物脱硫过程中油/水/生物催化剂分离困难，且很难重复利用的弊端；在外加磁场的作用下，易于实现生物催化剂的回收、再生；该方法制备工艺简单，易于工业化。迄今为止，未发现有关超顺磁性纳米颗粒原位吸附分离红球菌细胞并使之固定化的生物脱硫工艺的报道。