[发明专利]一种测定倍他米松的直接竞争酶联免疫测定试剂盒

权利要求书

1.本发明公开一种测定倍他米松的直接竞争酶联免疫测定试剂盒。

其特征包括：免疫原的制备，酶标抗原的制备，抗体制备和试剂盒各组份的配制及酶标板的包被。

2.根据权利1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，合成倍他米松免疫原的方法。用倍他米松溶于无水吡啶，搅拌下，加入羧甲基羟胺，倍他米松与羧甲基羟胺的摩尔比为1∶1.5左右，室温搅拌24小时后，减压抽干吡啶，得黄色油状物。加乙酸乙酯溶解，用蒸馏水洗三次，分离出有机相。加热减压去乙酸乙酯近干，加乙醚，置冰箱，得白色沉淀。为倍他米松-3-羧甲基肟，再与N-羟基丁二酰亚胺反应，用二环己碳二亚胺或水溶性碳二亚胺{1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二亚胺；1-环己-3-(2-玛啉-4-乙基)碳二亚胺-对甲基苯亚磺酸盐}催化，生成倍他米松-3-羧甲基肟活化物，该活化物与载体蛋白在碱性条件下，与载体蛋白上氨基相联，为倍他米松的免疫原。载体蛋白如：牛血清白蛋白，卵清蛋白，甲状腺球蛋白，大钥匙孔状槭血蓝蛋白。

3.根据权利1所述，其特征在于，合成一种酶标抗原的方法：首先合成倍他米松-21-琥珀酸半酯：倍他米松(0.1mml)和琥珀酸酐(0.15mmol)，加入无水吡啶，混合物在65℃下加热搅拌12h，将反应物转入pH 2～3(用盐酸调)的冰水中.置冰箱过夜，得白色沉淀，沉淀用去离子水洗数次，离心，干燥，得倍他米松-21-琥珀酸半酯。倍他米松-21-琥珀酸半酯，用四氢呋喃或二甲基甲酰胺为溶剂，4℃搅拌下，加入三正丁胺，氯甲酸异丁酯，生合成混合酸酐.为倍他米松-21-琥珀酸半酯的活化形式.此活化形式，在碱性条件下与酶相联，其酶可为：辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶。合成酶标抗原。

4.根椐权利1-3所述，制备的倍他米松试剂盒，其特征在于免疫原和酶标抗原用不同的合成方法。免疫原中，其载体蛋白是在倍他米松第3位上与之交联；而酶标抗原中，酶是在倍他米松第21位上与之相联，或免疫原在倍他米松21位上联接，酶标抗原在倍他米松3位上联接，如此组成一个不均一系统，增加了检测的灵敏度。组成一种不均一的直接竞争酶联免疫测定试剂盒。

5.根据权利1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于标准溶液和样品的配制，是用含0.1％～0.5％水杨酸钠和0.05％～0.1％吐温-20的0.1～0.01M的磷酸盐缓冲溶液。抗体稀释液是用含0.1～0.5％明胶的0.1～0.01M磷酸盐缓冲溶液。显色液为二组份，其中，一组份为显色缓冲液，由磷酸氢二钠和柠檬酸组成，每毫升含0.2～0.5μl30％H₂O₂；另一组份为四甲基联苯胺(TMB)液。TMB液用95％乙醇或二甲亚砜配制成1mg/ml浓度。

6.根据权利1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，采用羊抗兔抗体(二抗)包被96或48孔酶标板。用2％卵清蛋白液封闭孔中未吸附二抗的部位。

7.一种用不均一性的直接竞争酶联免疫测定方法，测定各种样品中倍他米松的方法。其特征在于：

(1)样品的前处理方法。用溶剂抽提方法，大大简化了测定过程。

(2)用权利1-6所述工艺组装的试剂盒测定，检测过程为：

用包被有羊抗兔抗体的酶标板，加入倍他米松抗体，孵育后洗涤甩干，加入标准或样品溶液和酶标抗原(倍他米松-辣根过氧化物酶)，孵育后洗涤甩干，加显色剂显色，终止，测定。标准或样品中倍他米松浓度的对数值与OD₄₅₀值呈反比。以此达到定量测定倍他米松的目的。此不均一的直接竞争酶联免疫测定试剂盒，检测范围为0.1～20ng/ml，灵敏度可达0.1ng/ml，IC₅₀1～2ng/ml。