[发明专利]一种测定蛋白质溶液中聚山梨酯含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及测定聚山梨酯含量的方法，特别涉及测定蛋白质溶液中聚山梨酯含量的方法。

背景技术

表面活性剂在与人体接触的体系如药物、食品、化妆品及个人卫生用品中的应用越来越广泛，但是表面活性剂及其代谢产物对机体可能造成毒副作用，包括急性毒性、亚急性毒性、慢性毒性、对生育繁殖的影响、胚胎毒性、致畸性、致突变性、致癌性、致敏性、溶血性等等。因此需要根据制品用途、表面活性剂的种类等情况对表面活性剂在制品中的含量加以控制。

非离子表面活性剂毒性较低，其中聚山梨酯类非离子表面活性剂在药剂中广泛用作乳化剂、分散剂、增溶剂和稳定剂，主要用于制造多种液体制剂(如芳香水剂、合剂、洗剂、乳剂等)、半固体制剂(如油膏剂、乳膏剂、栓剂等)，包括无菌、灭菌制剂(如滴眼剂、眼膏剂、注射液等)，一般含量为0.1％～2.0％。根据国内外临床和非临床安全性试验研究结果，这在安全范围之内。对于生物类药剂而言，这类物质在制剂(特别是注射类制剂)中的含量一般不高于0.05％。

对于其中使用聚山梨酯作为稳定剂的蛋白质制剂而言，即使不需考虑毒性方面的因素，也需要控制聚山梨酯的含量。这是因为蛋白质的性质比较脆弱，如果聚山梨酯的含量过低，则达不到稳定效果，如果聚山梨酯的含量过高，则反而可能促使蛋白质降解。

目前，测定聚山梨酯含量的方法主要有分光光度法、荧光光度比色法和分子排阻-蒸发光散射(SEC-ELSD)法。其中，荧光法和SEC-ELSD法实验条件要求较高，不利于推广，而分光光度法灵敏度高且操作简便，应用范围最广。《中国药典》中规定的聚山梨酯80残留量测定方法就是分光光度法(参见《中国药典》(2005年版)三部附录VIH)，其原理是利用聚山梨酯80中的聚乙氧基和铵钴硫氰酸盐反应形成的蓝色复合物溶于二氯甲烷后在620nm处有特异吸收，并且在一定剂量范围内，其吸收值呈剂量依赖。但该方法需要对样品中的蛋白质进行沉淀、洗涤、分离，并且还需要进行空气吹扫，样品在处理过程中容易丢失，会造成较大偏差；同时该方法需要在室温下放置过夜，时间较长，而二氯甲烷又易挥发，这也会影响实验结果。

已有人提出在上述测定蛋白质溶液中聚山梨酯含量的方法中使用90℃水浴来代替空气吹扫以浓缩样品溶液，其中仍需要进行蛋白质沉淀、洗涤、分离等步骤(参见“聚山梨酯80含量测定方法的改进验证”，崔志伟、杨黎明、高琼，科技资讯，2006年第12期第186页)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种测定蛋白质溶液中聚山梨酯含量的方法，该方法不需要对制剂中的蛋白质进行沉淀处理而直接进行测定，也不需要将样品过夜反应，并且克服由于二氯甲烷易挥发而检测时间间隔过长造成的差异。

为此，本发明提供一种测定蛋白质溶液中聚山梨酯含量的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将被检测样品与三氯甲烷和硫氰钴铵水溶液混合，得到混合液；

(2)使混合液分层；

(3)测量分层后得到的三氯甲烷层在紫外-可见波长下的吸光度；

(4)根据所测得的吸光度计算被检测样品中聚山梨酯的浓度。

在步骤(1)中，优选将被检测样品与三氯甲烷和硫氰钴铵水溶液以1∶2∶3的体积比混合。步骤(2)优选包括：将混合液置于60-65℃的水浴中5-30分钟，从而使所述混合液分层。步骤(3)优选包括：测量三氯甲烷层在620nm波长下的吸光度。步骤(4)优选包括：根据聚山梨酯标准品的吸光度-浓度标准曲线计算被检测样品中聚山梨酯的浓度。

聚山梨酯优选为聚山梨酯20或聚山梨酯80。蛋白质优选为非糖蛋白。蛋白质还优选为分子量在10千道尔顿以下的蛋白质。

硫氰钴铵水溶液优选是由3重量份的硝酸钴和20重量份的硫氰酸铵加水溶解至100体积份配制而成的。

本发明的方法的优点在于用三氯甲烷代替二氯甲烷，不需要使用乙醇-氯化钠饱和溶液等试剂对蛋白质进行沉淀，从而也不需要洗涤沉淀和分离沉淀，也不需要浓缩、放置过夜等步骤，并且克服由于二氯甲烷易挥发而检测时间间隔过长造成的差异，操作简便、快速、重复性好。

附图说明

图1是聚山梨酯20含量测定的线性标准曲线；

图2是聚山梨酯20和聚山梨酯80含量测定的线性标准曲线比较。

具体实施方式