[发明专利]一种洋葱假单胞菌基因工程菌的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及脂肪酶基因工程菌的构建方法。

背景技术

在能源危机越演越烈的今天，寻找高效、清洁的可再生能源是一项极为重要和迫切的任务，而利用废弃动、植物油脂转化生产生物柴油无疑是最有效、最直接的办法。目前生物柴油转化主要有化学法和酶法两种，其中化学法能耗高、污染大；酶法则具有反应条件温和、无污染等优点，是解决能源危机的有效途径。

酶法制备生物柴油的工艺中，脂肪酶的成本最高是制约工艺进一步发展的主要瓶颈之一，不同来源脂肪酶制备生物柴油的效率和得率也不同。研究表明洋葱假单胞菌脂肪酶在众多脂肪酶中能够催化的反应类型最多，反应活性和稳定性最高，对酸、碱、短链醇等物质的耐受性最高(Jaeger KE，Eggert T，lipases for biotechnology.2002)，是生物柴油制备工艺中最理想的催化酶。然而，洋葱假单胞菌脂肪酶需要在其本身分子伴侣的帮助下才能正确表达，它的分泌还和胞内Dsb复合体等十几个蛋白质有密切关系，由于缺乏相应的表达和分泌机制，洋葱假单胞菌脂肪酶的异源表达往往没有活性，即便体外复性，效率和产量也非常低。但是脂肪酶产生菌本身也存在代谢调控机理不明确、产酶量低、表达不稳定等问题。因此只有通过分子生物学手段构建洋葱假单胞菌脂肪酶同源表达菌株才能从根本上解决上述问题。

T7大肠杆菌表达系统是非常成熟的重组蛋白表达系统，它包括T7RNA聚合酶和一个能被T7RNA酶驱动的T7启动子。该系统严格依赖T7RNA聚合酶对其特有启动子T7启动子的特异选择性，T7启动子完全专一受控于T7RNA聚合酶(Tabor and Richardson，1985)，而高活性的T7RNA聚合酶合成mRNA的速度比一般RNA聚合酶快5倍，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白。基于T7RNA聚合酶的专一选择性和优越转录能力，Stidier等人(Studier，Moffatt，1986)首先在大肠杆菌BL21(DE3)中建立起一套受LacUV5启动子调控的T7表达系统。该系统在世界范围内得到非常广泛的应用，成为大肠杆菌中高效表达重组蛋白的首选。Elaine等人(ElaineBrunschwig，Aldis Darzins，1992)在铜绿假单胞菌中利用lacUV5/laIq构建的T7表达系统也得到普遍应用。此外Barnard等人(Barnard et al.，2004)在罗尔斯通氏菌也构建了T7表达系统。

发明内容

本发明的目的在于提供一种洋葱假单胞菌基因工程菌的构建方法，得到的基因工程菌具有较高的表达量和催化活力，并且具有较好的低碳醇耐受性以及耐高温性。

一种洋葱假单胞菌基因工程菌的构建方法，具体如下：

(1)采用同源重组方法去除洋葱假单胞菌G63基因组中原有的脂肪酶基因及其伴侣基因，同时导入T7RNA聚合酶基因，获得能够表达T7RNA聚合酶的洋葱假单胞菌重组菌；

(2)将目的基因克隆到含有T7启动子和LacI阻遏蛋白的表达质粒中；

(3)将质粒导入洋葱假单胞菌重组菌，得到洋葱假单胞菌基因工程菌。

所述步骤(2)中的目的基因为洋葱假单胞菌脂肪酶及其伴侣基因或者α淀粉酶基因或者纤维素酶基因。

本发明构建的同源重组菌染色体上原有的脂肪酶及其伴侣基因被T7RNA聚合酶基因替换，因此同源重组菌没有任何脂肪酶背景，可以方便应用于脂肪酶高通量筛选。而表达载体上位于T7启动子后的脂肪酶基因也受到LacI阻遏蛋白的负调控。因此认为，本发明的洋葱假单胞菌脂肪酶工程菌是受双重调控的良好表达系统。

培养该基因工程菌，在菌种密度达到一定程度时，加入相应的诱导物使脂肪酶基因开始表达并获得洋葱假单胞菌脂肪酶。优选分批发酵方法培养该工程菌，发酵结果显示工程菌的酶活比原始菌提高4倍以上。

由此可见，本发明构建的工程菌具有较高的表达量和催化活力，并且具有较好的低碳醇耐受性以及耐高温性，可以用来大量生产脂肪酶，具有工业实用性。

附图说明

图1为重组菌的生长曲线示意图。

图2为基因工程菌的质粒稳定性曲线示意图。

具体实施方式

本发明中的目的基因可以是洋葱假单胞菌脂肪酶及其伴侣基因，或者α淀粉酶基因或者纤维素酶基因，只要目的基因受T7启动子调节，都可在本发明构建的洋葱假单胞菌重组菌中进行高效表达。下面结合实施例对本发明作详细说明。

实例1：脂肪酶基因工程菌的构建。