[发明专利]家蚕滞育品种的低温催青转基因方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术、生物工程领域，特别是涉及一种家蚕滞育品种的低温催青转基因方法。

背景技术

转基因技术是现代生物学研究中的一项重要的技术，在功能基因研究、生物新产品开发、生物素材创新、现代遗传育种等方面发挥着重要的作用。

家蚕是重要的经济昆虫和鳞翅目昆虫模式生物。随着家蚕基因组测序工作的完成，利用高效稳定的技术大规模地研究重要基因的功能成为家蚕功能基因组时代的重要课题，同时，家蚕是理想的“昆虫工厂”，利用现代基因工程技术开发丝腺生物反应器具有巨大的市场前景。而家蚕转基因技术是探索家蚕生长发育奥秘、拓展蚕业产业链、促进科技成果实用化的有利武器。

自2000年日本科学家报道首次成功培育转基因家蚕以来，国内外已陆续报道转基因家蚕成功的消息。但是迄今为止的报道中，所有转基因实验都是利用家蚕多化性品系的非滞育卵，主要是因为多化性家蚕品种所产的卵为生种卵，其不需要任何的人工处理便能够在适当的温湿度下连续发育直至孵化，这个特点极大地方便了转基因实验中的操作控制和转基因后的进一步实验研究。但这些多化性家蚕品系与滞育性的生产上的家蚕实用品种比较，具有丝量少，丝质差等经济性状差的特点。故利用多化性家蚕品种作为转基因的材料具有以下两个方面的明显缺陷：①多化性家蚕品种经济性状差，利用转基因所创造的附加性状在产量和质量上都无法达到直接推广应用的标准，以多化性蚕种为原始材料的转基因品系只能作为育种原始材料，作为某一相关优良性状的原始载体的角色运用于漫长而艰辛的传统育种之中。②多化性家蚕品种不具有滞育期，对其继代维持只能依靠连续的饲养繁殖，这样需要浪费大量的人力和物力对获得的转基因家蚕品系进行维持和继代，同时也大大增加了获得的转基因家蚕品种资源丢失的风险。因此，利用多化性家蚕品种不但不利于进行大规模的转基因实验，而且很难使研究成果快速转化到生产实际中去。

家蚕滞育品种为一化或二化性品系，在产卵以后便进入一个比较漫长的滞育期，这样极有利于它们维持和继代。另外生产上的实用家蚕品系几乎都是滞育品系，多为一化或二化性品系。如利用普通的家蚕滞育品系进行转基因研究可以克服多化性家蚕品种转基因研究中所述的第二个缺陷，而利用生产上的实用家蚕滞育品系原种进行转基因研究则可以克服多化性家蚕品种转基因研究中所述的所有缺陷。因此，家蚕滞育品种的转基因研究具有极为重要理论和实际意义。生产实际中，滞育卵一般在产卵后约16-20小时左右利用常规的即时浸酸法能有效解除它们的滞育。而目前最有效的家蚕转基因显微注射时间是在产卵后3-6小时，因为转基因操作后卵上会上留下注射小孔，如果在注射后利用常规的即时浸酸法会导致盐酸渗入蚕卵内，从而致死，根本无法实现家蚕滞育品种的转基因研究。因此，家蚕滞育品种卵的滞育，给转基因操作带来很大的限制。

到目前为止，滞育性家蚕品种的转基因技术在国内外还未见报道，更没有一种成熟可靠的方法实现家蚕滞育品种的转基因，因此，探索家蚕滞育品种的转基因的方法，是简化家蚕转基因技术、加速科技成果实用化的迫切要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种家蚕滞育品种的转基因蚕的制作路线方法。该路线方法利用特殊的催青条件改变家蚕滞育品种下一代蚕卵的化性，使特殊的催青条件下获得的当代家蚕滞育品种蚕蛾交配，产下非滞育的下一代蚕卵，最后参照非滞育家蚕卵胚胎显微注射的转基因方法进行转基因，从而巧妙地突破家蚕滞育品种转基因技术的障碍并有效制作转基因蚕。

本发明首次系统地调查了低温催青对家蚕滞育品种下一代蚕卵化性的改变，并获得了通过低温催青使家蚕滞育品种产下非滞育的下一代蚕卵的条件，并将这项技术与家蚕胚胎显微注射技术，荧光检测与分子生物操作技术相结合，巧妙地突破了家蚕滞育品种转基因技术的瓶颈，建立了一种可靠的家蚕滞育品种的转基因技术路线方法。

本发明家蚕滞育品种的低温催青转基因方法，依次通过以下步骤实现：

(1)将家蚕滞育品种的蚕卵通过人工孵化处理后，置于15℃恒温、相对湿度75％的环境中催青至孵化，孵化的蚁蚕在常规条件下进行饲养；

(2)在25℃的种茧保护温度下收集同时化蛾的雌雄蚕蛾，在25℃、弱光的条件下交配4h后拆对，并将雌蛾投放于上浆的蚕连纸上，在黑暗的环境中产卵，每间隔1h收集一次蚕卵，并将收集的蚕卵置于25℃的环境中保护；

(3)将蚕卵连同蚕连纸片用自来水冲洗以后，于蒸馏水中浸泡2-3min，而后用镊子将蚕卵转移至用75％酒精消毒的载玻片上，并按照蚕卵腹面向右的标准将其排列整齐，排列好的蚕卵置于35-37％的甲醛蒸气中消毒5min；