[发明专利]一种灵芝孢子油的指纹图谱鉴别方法

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种用高效液相指纹图谱的方法鉴别灵芝孢子油。

背景技术

赤芝Ganoderma lucidum(Curtis：Fr.)Karst.英文名为Reishi mushroom，又称瑞草、灵芝草，日本称为万年茸，属于多孔菌科(Polyporaceae)灵芝属(Ganoderma)药用真菌，是中国的传统名贵中药，于2000年正式收载于《中华人民共和国药典》。现代科学证明赤芝具有广泛的药理作用。其中三萜类是赤芝的主要有效成分之一，自Kubota.T等人于1982年首次从赤芝子实体中分离得到三萜类化合物到目前为止，已先后从赤芝子实体和孢子粉中分离到了103种新的三萜类化学成分。三萜类化合物具有多种生理活性和药理作用，如ganoderic acid A，B，C，D能抑制小鼠肌肉细胞组胺的释放，赤子孢子酸A则对四氯化碳和半乳糖胺及丙酸杆菌造成的小鼠转氨酶升高有降低作用，其他灵芝三萜类化合物也均具有广泛的生理活性，如抑制肿瘤、抗病毒、抗衰老、调节免疫系统和心血管系统、抑菌、镇痛、保肝护肝等作用。

中药指纹图谱是指中药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到能够标示该中药特征的共有峰图谱，通过把握中药指纹的特征，有效地鉴别中药的质量，确保中药材及中成药质量相对稳定，现在已经成为控制中药质量的一种有效的方法。但是因灵芝孢子油成分复杂，尤其是三萜类化学成分种类繁多，给灵芝孢子油的质量控制带来了很大的麻烦。

中国专利申请200510035987.1公开了一种灵芝孢子与灵芝孢子油指纹图谱的建立方法，试图提供一种对灵芝孢子与灵芝孢子油的质量控制和鉴别方法，但其方法中采用所有植物油类共有的基础成分甘油三油酸酯做为参照物，从而使得所得到的图谱对灵芝孢子油选择性和专一性有相当大的缺陷，并且其图谱中的甘油三油酸酯峰面积极大而灵芝孢子油中有效成份的峰较少，很难保证能准确区分出其他植物油与灵芝孢子油，更不用说鉴别在灵芝孢子油中掺杂了其他植物油的情况。同时其色谱条件中的流动相对灵芝孢子油有效成份的选择性弱且价格昂贵、检测器稀有，这些都限制了此方法的应用。

发明内容

本发明的目的是为了克服灵芝孢子油的质量难以的控制问题，利用高效液相色谱，建立了对灵芝孢子油的有效成份三萜组分具有强针对性和选择性的高效液相指纹图谱，从而对灵芝孢子油进行质量控制。

本方法克服了在指纹图谱建立的步骤中需要使用参照物的常规思维，先精确量取灵芝孢子油正品，然后在没有参照物的的条件下精确选择色谱条件，通过大量实验从而选择出对灵芝孢子油三萜组分具有强针对性和选择性的高效液相色谱条件并进一步得到了灵芝孢子油三萜组分标准高效液相指纹图谱；通过此对三萜组分具有针对性和选择性指纹图谱来鉴定灵芝孢子油并检测灵芝孢子油的含量。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

一种灵芝孢子油的指纹图谱鉴别方法，包括如下步骤：

第一步，建立灵芝孢子油三萜组分标准高效液相指纹图谱，方法如下：

a、供试品溶液的制备：取灵芝孢子油样品300mg，用50％甲醇-50％乙酸乙酯的混合溶液溶解，定容到25ml；

b、高效液相色谱分析：取20ul供试品溶液进样，连续进样5次；色谱条件：色谱柱为luna C18柱，流动相为乙晴-磷酸(优选体积比为40∶60)，柱温为30℃，流速为0.8ml/min，检测波长为234±1nm；得到灵芝孢子油三萜组分高效液相指纹图谱；

c、测定10批灵芝孢子油的高效液相指纹图谱并进行比较，得到由其共有特征峰构成的灵芝孢子油三萜组分标准高效液相指纹图谱；

灵芝孢子油三萜组分标准高效液相指纹图谱中，共有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10十个主要色谱峰，其中前八个峰的保留时间分别为32.22min、33.52min、34.60min、35.36min、38.95min、39.77min、40.08min、41.22min，十个主要色谱峰的峰面积均占总峰面积的5％以上，且其面积之和占总峰面积的80％以上；本发明的10批次样品的重叠率较好，均在90％以上。

第二步，以上述相同方法测定待测灵芝孢子油样品三萜组分高效液相指纹图谱。

第三步，将待测样品高效液相指纹图谱与上述标准高效液相指纹图谱进行对比、鉴别：当样品有10个主要色谱峰且保留时间与标准指纹图谱上的保留时间顺序一致，峰1，2，5，6，7，8的峰面积之和占总峰面积的百分比在80％以上时，即可认定待测样品灵芝孢子油为正品。