[发明专利]大肠杆菌TolC抗体靶向作用提高耐药菌对抗生素敏感性的技术

说明书

技术领域

本发明涉及大肠杆菌(E.coli)TolC抗体靶向作用提高耐药菌对抗生素敏感性的技术方法。

背景技术

近年来细菌耐药日趋严峻，成为医药界倍受关注的问题。由于抗生素滥用造成细菌耐药性问题尤为突出。我国临床分离的一些细菌对某些药物的耐药性已居世界首位。除耐青霉素的肺炎链球菌、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、肠球菌、真菌等多种耐药菌外，进入我国仅20多年的喹诺酮类抗生素的耐药率已经达60％-70％。据报道，包括广州在内的国内一些大城市人群感染的金黄色葡萄球菌中。80％已经产生了对青霉素G的耐药性。凯福隆、失孢三嗪等第三代的头孢类茵抗生素的应用已日趋普遍，抗生素品种的选用明显超前。抗生素的滥用主要是由于抗生素生产和销售管理薄弱、临床的误用和滥用、以及将抗生素作为生长促进剂在动物养殖中广泛使用所导致。由于在抗生素使用与病原菌耐药水平之间存在着一种宏观的量化关系，即一定范围内的抗生素使用可以导致病原菌整体耐药水平以及耐药菌感染率的变化。由此，人和动物的肠道正常菌群暴露于抗生素而普遍产生耐药性，并通过粪便直接污染环境、水、食品，导致耐药菌不断增加，也使人体接触耐药菌的机会不断增加。因此耐药菌的种类非常广泛。这样一来，人体如果再获得耐药菌的感染治疗起来就比较困难。因此.控制目前已经广泛存在的耐药菌己成为一个重要的社会和科学问题。

耐药菌的防制尚不能完全寄托在新抗生素的发现和发明，因为抗生素的生产与发展伴随着细菌耐药性的不断发展，一种新的抗生素投入使用后，很快就发现有相应的抗性菌株出现。在细菌中普遍存在的抗药性是对抗菌药物的生产开发及对细菌性疾病防治的一个巨大挑战，直接危害食品安全和人类健康。对细菌耐药机理的深入研究，发现其作用靶点是解决这一难题的关键。虽然不同的细菌对相同的抗生素以及同一细菌对不同的抗生素的均各有其特点，但在外膜的耐药机制中可能具有明显共性，即通过影响膜通透性以及抗生素排出系统起作用。这些作用不是单个蛋白而是一个蛋白质组在起作用。因此，通过对细菌外膜耐药蛋白质组的研究，可望筛选获得针对细菌耐药的共性蛋白作为药物作用靶点。

在肿瘤治疗方面，针对活性作用靶位可以采用抗体靶向疗法，即通过抗体与该靶位结合以负调其功能，达到抑制肿瘤细胞生长的目的。迄今为止，虽然已有采用杀菌性抗体抑制细菌的文献，但无采用抗体负调与耐药相关活性蛋白的功能达到抑制耐药菌生长的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供大肠杆菌TolC基因编码蛋白(TolC)作为一种抗体靶向作用的靶点，达到抑制耐药菌的目的的技术方法。

本发明通过比较亚蛋白质组学和免疫印迹(Westem blotting)技术，证明氯霉素耐药大肠杆菌外膜蛋白TolC、OmpC、OmpW、OmpT、FadL、Lamb发生明显变化，其中前4种出现上调，提示TolC、OmpC、OmpW、OmpT可以作为抗体靶向负调的作用靶标。

本发明为进一步证明上述结论，对上述蛋白的基因缺失株进行最小抑菌浓度测定和在含有抗生素培养基中生存能力的评价，发现其缺失株的最小抑菌浓度发生变化、细菌存活率明显下降，其中TolC缺失株的存活率最低。这些结果证明TolC是抗体靶向负调的良好作用靶标。

本发明采用抗体靶向疗法，证明抗TolC抗血清(抗体)能够在含氯霉素和链霉素的培养基中强烈抑制包括耐药大肠杆菌在内的该种细菌的生长。经抗TolC抗血清处理后的细菌，其生长被抑制的程度与同条件培养下TolC缺失株的生长情况一致。这些结果说明抗TolC抗体靶向作用可以明显负调TolC的功能，达到抑制耐药菌生长的目的。

综上所述，大肠杆菌TolC抗体靶向疗法能够明显抑制耐药菌的生长，为耐药菌的治疗提供了一种崭新的技术方法。

附图说明

图1为用肉汤稀释法测定的氯霉素耐药菌(CAP-R)及其来源菌株(CAP-R-O)的最小抑菌浓度。

图2为CAP-R和CAP-R-O外膜蛋白表达的双向电泳图谱

图3为差异蛋白局部放大图

图4为免疫印迹技术鉴定的CAP-R和CAP-R-O中TolC差异表达

图5为CAP-R和CAP-R-O在不同氯霉素浓度时的生长曲线

图6为缺失菌株对氯霉素的最低抑菌浓度

图7为氯霉素对缺失株的生存的影响

图8为TolC抗体对细菌生长的抑制作用。A，免疫前血清和TolC血清分别处理对CAP-R，CAP-R-O和△tolC在加和不加氯霉素培养基中生长的影响。B，A的抑制率比较(*表示有显著性差异(P<0.01))