[发明专利]重组禽腺联病毒载体介导的鸡输卵管生物反应器制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和生物制药领域。

背景技术

目前，药用重组蛋白的表达系统主要有细菌表达、动物细胞表达和转基因动物生物反应器。细菌表达系统以大肠杆菌为典型代表，其技术难度不大，生产成本较低，但表达的重组蛋白一般不能进行有效的折叠、加工和修饰，所以多为不溶性的包涵体，不仅活性低或无，而且对目的产物的纯化不利。动物细胞表达的最大优点是产物的活性完全，但表达水平普遍偏低，生产成本较高。转基因动物生物反应器是利用基因工程和胚胎工程技术，将编码贵重蛋白的基因转移到动物胚胎，以转基因动物的组织或器官作为生产重组蛋白的生物工厂，具有表达水平高、表达产物活性完全和无污染等突出优点，具有十分光明的产业化前景，但其技术难度很大，许多理论和技术难题均有待突破。

作为转基因动物生物反应器，鸡具有十分突出的优势，其输卵管膨大部是合成蛋白的天然工厂，能对表达蛋白进行正确的加工和修饰，所以表达产物活性完全，还有饲养成本低、世代间隔短、产蛋易收集和不易污染等优点。制备家禽输卵管生物反应器的基本原理是利用卵蛋白基因表达调控序列指导外源基因在鸡输卵管细胞中表达，从蛋清中获得表达产物。鸡输卵管生物反应器包括转基因鸡输卵管生物反应器和鸡输卵管暂态表达生物反应器，前者具有遗传稳定、表达水平高等突出优点，但其技术难度很大，目前只有少数报道；后者的缺点是外源基因不能遗传、表达水平偏低且短暂，但其技术难度不大，日本科学家曾用含人碱性磷酸酶基因的表达载体转染鸡输卵管细胞，使重组酶在蛋清中获得低水平短暂表达，但需要特殊的仪器设备和对鸡进行外科手术，没有实用价值。

腺联病毒(AAV)是多数动物常见的小DNA病毒，其复制依赖于腺病毒等辅助病毒的存在。作为一种新型的基因转移载体，重组腺联病毒具有非致病性、免疫原性低、感染细胞种类广和外源基因表达稳定等优点，已广泛用于基因治疗和基因工程疫苗研究。禽腺联病毒(AAAV)具有其它动物腺联病毒类似的生物学特性和基因组结构，已被证明能有效介导外源基因在禽源细胞中表达，但目前尚未用于禽输卵管表达重组蛋白研究。

发明内容

本发明的目的在于建立简单、非手术、经济、实用的重组禽腺联病毒介导的鸡输卵管表达重组蛋白生物反应器的制造方法。

本发明的技术方案包括鸡输卵管特异表达载体的改造、含鸡输卵管特异表达调控元件和人组织激肽释放酶基因的禽腺联病毒转移载体的构建、重组病毒的制备、产蛋鸡的重组病毒注射：

a、鸡输卵管特异表达载体pOV3K的改造：根据鸡输卵管特异表达人组织激肽释放酶基因(KLK1)的pOV3K载体的限制性酶切图谱，用限制酶Hind III和Hpa I消化，切除其中的鸡卵清蛋白基因(ov)的1568-2860核苷酸区域，回收的4.7kb片段经Klenow酶补平，连接后获得由1.7kb ov 5′调控区和牛生长激素基因polyA控制人KLK1基因表达的鸡输卵管表达载体pOV5K。

b、含鸡输卵管特异表达控制元件和KLK1基因的禽腺联病毒(AAAV)转移载体的构建：根据AAAV基因组DNA序列限制性酶切图谱，先用限制酶Pml I将含AAAV全基因组的重组质粒pCR-AAAV线性化，电泳分离后回收，再用限制酶BsmB I消化，电泳分离后回收含AAAV末端反向重复序列(ITR)的4.1Kb片段，用Klenow酶补平后，获得AAAV转移载体pAITR；根据鸡输卵管特异表达载体pOV5K中ov基因5′调控序列和牛生长激素基因PolyA 3′序列设计一对引物，以pOV5K载体为模板，用PCR扩增KLK1 cDNA表达盒，与转移载体pAITR连接，获得由ov 5′调控区和牛生长激素基因PolyA控制KLK1 cDNA表达的AAAV转移载体pAITR-OV5K。

上述引物为：

Forward：5-CTTGGCGCGCGCAGACTGACATGCATTTCATAGG-3

Reverse：5-TCGGGGTACCAGCGGAAGAGCGCCCAATACG-3

c、重组AAAV的制备：将转移载体pAITR-OV5K、辅助质粒pcDNA-ARC与腺病毒辅助质粒pHelper组成三质粒系统，转染AAV-293细胞，获得鸡输卵管特异表达KLK1基因的重组AAAV。

d、产蛋鸡的重组病毒注射：用PBS缓冲液溶解纯化和浓缩的重组病毒，并稀释成2×10¹⁰病毒颗粒/毫升，翅静脉注射产蛋鸡，用免疫转印和酶活性检测法测定蛋清中目的蛋白的表达水平和组织特异性。