[发明专利]制备静脉注射用双病毒失活的免疫球蛋白的方法

说明书

发明背景

本发明涉及一种生产静脉注射用的免疫球蛋白的完整、多步的工业化生产方法。其中该免疫球蛋白包含的主要成分为IgG(γ-球蛋白)。

已知有多种从由人类血浆的科恩分级分离(Cohn fractionation)得来的起始物质中获得静脉注射用γ-球蛋白的方法。一些科恩级分(fraction)比其他的科恩级分包含有更高效价的γ-球蛋白。常用的用于制备γ-球蛋白溶液的起始物质为科恩级分II或科恩级分II+III。

尽管在现有技术中人们采用了多种分离和杀菌技术，仍需要不断探索改进方法以提高终产物的纯度、安全性和总产量。

很多工业化生产方法使用溶剂/去污剂或热处理步骤使病毒失活。到目前为止，还没有提出过以科恩级分II或科恩级分II+III糊状物为起始物质的多步方法。该多步方法包括以两种不同的病毒失活步骤作为高效、高产量的γ-球蛋白生产方法的一部分。

Kaneyama等人的美国专利第5,151,499号中提供了一种制备病毒失活的蛋白质组合物的方法，其中将该蛋白质组合物进行蛋白质组合物的溶剂/去污剂处理中的包壳病毒的病毒失活以及蛋白质组合物的的热处理中的非包壳病毒的病毒失活。美国专利第5,151,499号中指出优选使溶剂/去污剂步骤在蛋白酶抑制剂存在的情况下首先发生，接下来进行热处理，该热处理在大部分实例中为干燥的热处理。如果热处理在液态下进行，在任何热处理之前，通过将蛋白质吸附至一个离子交换柱而从溶剂/去污剂中回收。液态热处理可在糖、糖醇或氨基酸稳定剂存在的情况下进行。尽管美国专利第5,151,499号中列出了很多包含免疫球蛋白的起始蛋白质组合物，其生产实例采用了VIII因子、IX因子、凝血酶、血纤维蛋白原和纤维结合素。

Uuki等人的美国专利第5,371,196号中提供了纯化分泌性免疫球蛋白A的方法。其中描述了液态热处理或多种液态热处理与溶剂处理病毒失活相结合的方法。其中每一步之后都使用了聚乙烯乙二醇分级分离，并且总作为最终步骤。该发明没有涉及到高γ-球蛋白效价的血清免疫球蛋白。

一些现有技术中生产可静脉注射的γ-球蛋白溶液的方法描述了在山梨醇热稳定剂存在的情况下、以科恩级分II+III糊状物为起始物的多步纯化步骤进行的液态热处理的结合。Hirao等人的美国专利第4,845,199号中，使科恩级分II+III经聚乙烯乙二醇(后文中称为“PEG”)分级分离(8％w/v PEG用来沉淀杂质，接着用12％w/v PEG聚集以沉淀γ-球蛋白)，接着进行离子交换色谱分离，除去人血型抗体，然后，在作为蛋白质稳定剂的山梨醇存在的情况下进行液态热处理。另一方面，Hirao等人的美国专利第4,876,088号中的实施例1描述了从科恩级分II+III糊状物中制备可静脉注射的γ-球蛋白的方法，其中，糊状物悬浮于水中，pH值调至5.5，进行离心分离，上清液随后在33％w/v山梨醇存在的情况下进行热处理使病毒失活，接着进行PEG分级分离(6％/12％)，然后进行包括DEAE-Sephadex离子交换色谱法等的其它纯化步骤。

发明概述

本发明的目的之一是提供一种完整的、工业上可用的方法，以由科恩分级分离方法生产高纯度γ-球蛋白溶液。

本发明的另外一个目的是提供一种非常纯的可静脉注射的γ-球蛋白溶液，其不含包括各种热敏感病毒在内的包壳病毒和非包壳病毒。

本发明的再一个目的是提供一种工业上可用的γ-球蛋白方法，包括两个连续的病毒失活步骤，而不需要在第一个病毒失活步骤之后或第二个病毒失活之前回收γ-球蛋白。

本发明提供了本领域的技术人员显而易见的上述或其它目的，其中可被部分纯化、富含γ-球蛋白的乙醇科恩级分，首先经PEG分级分离，然后经过两步病毒失活处理，一步为在溶剂、优选为溶剂-去污剂混合液存在的情况下进行的病毒失活，以破坏包壳病毒，另一步为热处理病毒失活，在这两步之间不需要回收γ-球蛋白。接下来，将任何热处理形成的凝聚物从热处理和溶剂处理过的溶液中分离出来。

在本发明的一个优选实施方案中，山梨醇作为热稳定剂，三烷基磷酸盐作为溶剂。

在本发明的另外一个实施方案中，在溶剂-去污剂处理之前除去所有存在的颗粒。

在本发明的另外一个实施方案中，在病毒失活完成以后，γ-球蛋白溶液经PEG分级分离。

在本发明另外一个实施方案中，在病毒失活完成以后用阳离子交换树脂处理γ-球蛋白溶液。

在本发明的一些优选实施方案中，进行一步聚乙烯乙二醇分级分离步骤而不需要沉淀γ-球蛋白。