[发明专利]酶－蛋白质复合物

说明书

本发明涉及一种酶、蛋白质和载体复合物，此复合物是通过将具有特异结合其他物质能力的蛋白质结合到与载体共价结合的酶上而制备。这种复合物可用于免疫测定，如用于免疫组织化学和酶免疫测定等。

由于最近时期免疫化学上的进展，利用抗原-抗体反应来高灵敏地检测痕量物质的免疫测定术被广泛应用。目前，通常采用的两种免疫测定是免疫组织染色和酶免疫测定。

免疫组织染色是一种用识别特异性抗原的抗体来检测组织中特异性抗原的的方法。一般地，抗原抗体识别反应是在一薄的组织切片上进行的，组织切片的制备包括固定和石蜡包埋等步骤。抗原的存在与否是通过与之反应的抗体的有无来确定。首先被用来与抗原反应的抗体通常称为一抗。当与一抗结合的物质发出可见或可被仪器检测的信号时，信号的强度即显示一抗的量，而一抗的量是与样品中抗原的量呈正相关的。能够发出信号的物质有荧光物质和酶等。在免疫组织染色的早期发展阶段主要是利用荧光物质，而那样就必须用荧光显微镜来检测信号。

随后，Nakane等发展了酶标抗体的方法，使得用普通光学显微镜来分析染色图象成为可能。目前，酶已经被广泛应用为发出信号的物质。在免疫组织染色中，通过对结合在一抗上的酶引入发色物质来产生显色反应，而显色反应的强度显示了相应的酶活性。因此，显色反应的强度也就显示了酶标抗体的量，也即组织样品中抗原的量。然而，用这种方法可能得不到足够的灵敏度。

目前通常采用的方法称为链霉抗生物素蛋白-生物素法(SAB法)，即一种放大结合在抗原上的一抗的信号的方法。此方法包括首先使识别组织样品中特异性物质的一抗与之反应，然后加入能结合一抗的第二抗体。通常，二抗是能识别并结合一抗的多克隆抗体。这样，多个分子的二抗就被结合到一抗上。而每个二抗分子上已经被事先结合上了多分子的生物素。而随后用结合上链霉抗生物素蛋白的酶来与此一抗-生物素结合的二抗复合物反应。由此形成了一抗-生物素结合的二抗-链霉抗生物素蛋白结合的酶的复合物。因为每个一抗分子上结合了多分子的生物素结合的二抗分子，而每个生物素结合的二抗分子上又结合了多分子的链霉抗生物素蛋白结合的酶，间接结合在一抗分子上的酶量得以显著增加。这就使得组织样品上的抗原被以极高的灵敏度检出。

如前所述，由于结合在抗原上的一分子一抗上可最终结合多分子的酶，而这样就产生了更强的信号，因此，SAB法是一种很好的免疫测定方法。然而，从另一方面讲，此方法要求三个步骤：一抗反应、二抗反应和酶制剂反应。由于要求烦琐的步骤，SAB法不能在要求简捷、快速和精确的临床应用等方面广泛使用。因此，SAB法有待改进。

另外一种常用的免疫测定术被称为酶免疫测定(EIA)，经典的酶免疫测定方法和步骤如下：首先，用来识别某种待测物质的抗体被固定在聚苯乙烯珠或微量培养板等载体上。在载体被清蛋白等封闭后，作为待测目标的含有抗原的样品溶液被滴加。随后，再加入结合上酶的识别特异性抗原的抗体(酶标抗体)。换句话说，抗原被“插”到两个抗体的之间。接着洗去多余的酶标抗体，用酶的显色底物来发生显色反应。因为抗原的量由酶的活性而定，样品中抗原的浓度就可以通过和已知浓度抗原的显色反应来比较而确定。许多因素影响酶免疫测定的灵敏度，其中酶标抗体的质量是最重要的因素之一。尤其重要的是，当酶标抗体上结合了更多酶分子时，更强的信号被检测到，而这样抗原就可以被高灵敏度的测定。

如前所述，对免疫测定而言，酶标抗体的质量就显得尤为重要，酶标抗体的质量极大的影响着测定体系的灵敏度和测定步骤的烦琐程度。下面数例阐明了为使酶标抗体达到更高的灵敏度而采取的不同的尝试。这些尝试大部分包括在某种载体上结合更多的酶和抗体。

在日本专利申请公开(Japanese Patent ApplicationPublication)JP-A63-503138(1988)中，抗体被结合到已经结合上可检测标记衍生物的载体上，可检测标记包括药物、毒素、螯合剂和硼加合物等。利用氨基葡聚糖作为载体，首先，一种药物例如氨甲蝶呤(methotoxate)被结合到氨基葡聚糖上；在过碘酸钠存在的条件下抗体的糖链被氧化产生醛基，醛基和氨基葡聚糖反应，随后，由氢硼化氰还原产生共价键，从而形成药物、抗体和氨基葡聚糖复合物。

在日本专利申请公开(Japanese Patent ApplicationPublication)JP-A3-158758(1991)中，由过碘酸钠氧化葡聚糖产生的醛基与碱性磷酸酶和抗体的氨基反应，再用氢硼化钠还原，从而制备酶、抗体和葡聚糖复合物。