一种用于咖啡因检测的人工抗体的制备方法,制备的人工抗体洗脱位于印迹球层中的印迹分子,内部形成与印迹分子结构、大小和功能基互补的空穴结构,具有对酶标抗原分子的特异性识别位点,实现对酶标抗原分子选择性识别,利用化学免疫发光法,实现对酶标抗原分子痕量检测,检测限为5.2×10
1.一种用于咖啡因检测的人工抗体的制备方法,其特征在于:所述的人工抗体中洗脱位于聚合物印迹壳层中的印迹分子,印迹壳层的内部形成具有与印迹分子结构、大小和功能基互补的空穴结构,洗脱印迹分子的人工抗体具有对酶标抗原分子的特异性识别位点,实现对酶标抗原分子选择性识别,检测液中存在化学发光剂,利用化学免疫发光法,实现对酶标抗原分子进行痕量检测,上述人工抗体的制备过程包括如下四个步骤:1.1第一步是辣根过氧化物酶的氧化:称取4 ~ 6mg辣根过氧化物酶溶解于1 ~ 3mL新鲜配制的含有高碘酸钠的醋酸缓冲液中,室温下避光反应20 ~ 40min,加入适量的甘油,室温下继续避光反应5 ~ 15min后,对醋酸缓冲液透析2 ~ 4h,再用的碳酸钠将透析后辣根过氧化物酶溶液的pH值调至9.5备用;1.2第二步是辣根过氧化物酶标抗原的制备:量取81mL的Na2HPO4、和19mL的NaH2PO4配置pH为7.4的PBS缓冲液,然后用上述的PBS缓冲溶液分别配置浓度为300、30、3、0.3、0.03、0.003 mg•L‑1的抗原,用量程范围为10 ~ 100μL的微量进样器吸取40 ~ 60μL的上述活化后的辣根过氧化酶,滴加到上述的不同浓度的抗原溶液中,反应2 ~ 3h后,得到了辣根过氧化物酶标抗原,再用微量进样器分别吸取酶标抗原40 ~ 60μL,滴加到96孔板中,每种浓度的酶标抗原滴加12个平行样,随后在加入酶标抗原的孔中加入140 ~ 160μL的发光液,常温避光振荡器振荡反应4 ~ 6min,用化学发光仪检测其发光值,选择最大发光值为分子印迹的酶标抗原;1.3第三步是分子印迹聚合物的制备:称取30 ~ 40mg印迹分子置于100mL磨口锥形瓶中,分别加入70 ~ 80mL的乙腈,60 ~ 70μL功能单体,室温下,用振荡器振荡1 ~ 2h,再放置11 ~ 13h,然后加入700 ~ 800μL交联剂和90 ~ 110mg引发剂,通氮气超声4 ~ 6min使其充分混匀后,密封后置于温度可调控的恒温箱,以转速为250 ~ 350r/min,60℃聚合反应18 ~ 20h后,再调节温度至65℃熟化反应1 ~ 3h,取出锥形瓶冷却至室温,分别用乙醇和去离子水离心超声洗涤反应混合物各三次,得到目标分子印迹聚合物;1.4第四步是人工抗体的制备:将上述得到的目标分子印迹聚合物用滤纸包裹后放置于洗脱装置中,再将100 ~ 160mL体积比为9:1(mL:mL)的甲醇与乙酸混合溶液加入上述装置中,反复洗脱印迹分子聚合物,直至用紫外分光光度计检测不到混合溶液中印迹分子,然后再用甲醇洗去过量乙酸,将洗脱印迹分子聚合物放置在60℃的干燥箱中干燥,得到了具有对辣根过氧化物酶标抗原识别的人工抗体,然后通过包被液的包被,利用化学发光剂,实现对酶标抗原的检测。
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