本发明公开一种绝对定量检测总霍乱弧菌与致病性霍乱弧菌的试剂盒及检测方法。本发明首先提供了一种绝对定量检测总霍乱弧菌与致病性霍乱弧菌的引物和探针,所述引物和探针为两组:一组用于检测总霍乱弧菌:其引物核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示,探针核苷酸序列为SEQ ID No.3所示;另一组用于检测致病性霍乱弧菌:其引物核苷酸序列为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示,探针核苷酸序列为SEQ ID No.6所示。本发明还提供了利用微滴式数字聚合酶链式反应绝对定量检测总霍乱弧菌与致病性霍乱弧菌的方法,该方法特异性强、灵敏度高、扩增效果好,可操作性强,易于标准化。