[发明专利]一种温山药转基因毛状根的诱导方法

摘要

一种温山药转基因毛状根的诱导方法，属于植物培养和转基因技术领域。该方法包括：1)外植体的消毒；2)外植体的培养；3)侵染液的制备；4)毛状根的诱导和繁殖；5)毛状根的繁殖。本发明以温山药带叶腋的茎段为外植体，通过对诱导培养基、分化培养基和生根培养基进行优化，通过诱导、分化和生根培养获得完整植株，再通过发根农杆菌K599(带重组质粒pRI101‑AN‑gfp)活体侵染温山药无菌苗的茎，获得转基因毛状根，并通过PCR和荧光显微观察鉴定毛状根为转基因毛状根，建立了温山药转基因毛状根诱导体系，实现了温山药的快速有效繁殖。

主权项

1.一种温山药转基因毛状根的诱导方法，其特征在于包括以下步骤：1)外植体的消毒取外植体进行清洗、消毒，再将叶片剪成1cm见方小块，带或不带叶腋的茎段均剪成长0.5‑1cm；2)外植体的培养取步骤1)得到的外植体接种于诱导培养基上，每瓶接种3‑5个，遮光培养15‑25天，获得愈伤组织；取愈伤组织剔除愈伤四周褐化的部分，转入分化培养基上，光照培养20‑30天，获得丛生芽；取丛生芽切割后的单个芽转入生根培养基上，光照培养15‑20天，获得完整植株；所述诱导培养基为含2.0mg/L的2,4‑D的MS培养基，所述分化培养基为含6‑BA 2mg/L+IAA 0.5mg/L的MS培养基，所述生根培养基为含1.0mg/L IAA的MS培养基；诱导培养、分化培养和生根培养的培养温度均为24±2℃；3)侵染液的制备取重组型发根农杆菌K599经活化和培养后得到侵染液；4)毛状根的诱导和繁殖取转接后12‑15d、生长旺盛组培苗，用灭菌的解剖针在组培苗茎上刺出多个伤口，将2‑10μL侵染液滴加到伤口处，随后将侵染后的组培苗继续在24±2℃、遮光培养15‑30天，得到毛状根；5)毛状根的繁殖待毛状根长2‑3cm后，剪下毛状根并转入含500mg/L Cef+50mg/L Km的MS培养基上，每20‑30d继代1次，经过3‑4次继代完全杀灭农杆菌后，转入MS基本培养基繁殖毛状根。