[发明专利]一种肝性脑病细胞模型及其构建方法

摘要

本发明属于脊椎动物的新品种技术领域，公开了一种肝性脑病细胞模型及其构建方法，大鼠星形胶质细胞、神经元细胞的分离、纯化及细胞培养小室里共培养，加入不同浓度氯化铵后形成肝性脑病细胞模型；解决了目前肝性脑病主要采用动物模型，其成本高，耗费时间长，及过于复杂的体内环境对实验结果易产生偏差；而现有的有关肝性脑病的细胞模型均过于粗糙、简单，不能很好的模拟疾病过程的问题。本发明一种肝性脑病细胞模型的建立，尤其是以星形胶质细胞、神经元细胞共培养及不同浓度高氨为设计对象的模型，对肝性脑病的研究及治疗十分重要。

主权项

1.一种肝性脑病细胞模型的构建方法，其特征在于，所述肝性脑病细胞模型的构建方法包括：步骤一，出生24小时内的SD大鼠用75％酒精消毒，超净台里取两侧大脑皮层组织，37℃条件下加入0.125％胰蛋白酶消化15min后加入含10％胎牛血清DMEM培养基终止消化，洗涤两次后加培养基成初细胞悬液，经200目筛网滤过后接种至多聚赖氨酸包被培养瓶中；于37℃，5％CO₂培养箱孵育24h后换液，后每培养3天换一次液；约9‑12d，细胞铺满瓶底后，培养瓶内保持无菌于恒温摇床震荡18h，舍弃脱落细胞悬液后，进行GFAP免疫荧光鉴定，鉴定成功的细胞即为原代星形胶质细胞；步骤二，‑20℃冷冻麻醉E16‑E18母鼠15min后用75％酒精消毒，超净台里取胚胎鼠两侧海马组织，37℃条件下加入0.125％胰蛋白酶消化15min后加入10％胎牛血清DMEM培养基终止消化，洗涤两次后加NB+B27培养基成初细胞悬液，经200目筛网滤过后接种至多聚赖氨酸包被培养瓶中；于NB+B27+0.5mmol/L现配谷氨酰胺培养基，37℃，5％CO₂培养箱孵育，贴壁4h换液，后每培养3天换一次液，每一次换半液，约5d，进行MAP2免疫荧光鉴定，鉴定成功的细胞即为神经元细胞；步骤三，无菌条件下，密度为1*10⁵/ml的星形胶质细胞接种在带有Transwell培养小室的下层培养板上于含10％胎牛血清DMEM培养基中过夜，后换成NB+B27+0.5mmol/L现配谷氨酰胺培养基加入不同浓度NH₄Cl，于37℃，5％CO₂培养箱孵育24h；步骤四，无菌条件下，上述带Transwell培养小室的培养板的微孔膜上接种密度为1*10⁵/ml的神经元细胞，于37℃，5％CO₂培养箱继续孵育24h‑48h，形成神经元细胞和星形胶质细胞共培养体系。