[发明专利]不同组织来源的间充质干细胞混合培养方法

摘要

本发明提供的不同组织来源的间充质干细胞混合培养方法包括：从哺乳动物的脂肪组织、骨髓组织、脐带组织中分离提纯出间充质干细胞，将从脂肪组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第一间充质干细胞，将从骨髓组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第二间充质干细胞，将从脐带组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第三间充质干细胞；将第一间充质干细胞、第二间充质干细胞、第三间充质干细胞按2:3:1比例混合，进行混合培养。采用混合培养时不同组织来源的间充质干细胞分泌的多种细胞因子可以相互促进增殖，同时添加的自体脐带血血清使得增殖更快，细胞一致性更好，解决了增殖不一致、增殖缓慢、传代少、需要多种规格培养基的问题。

主权项

1.不同组织来源的间充质干细胞混合培养方法，其特征在于，包括：从哺乳动物的脂肪组织、骨髓组织、脐带组织中分离提纯出间充质干细胞，将从脂肪组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第一间充质干细胞，将从骨髓组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第二间充质干细胞，将从脐带组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第三间充质干细胞；将从脂肪组织、骨髓组织、脐带组织中分离提纯出的间充质干细胞进行混合培养，具体为：将第一间充质干细胞、第二间充质干细胞、第三间充质干细胞按2:3:1比例混合，组成P1代混合细胞；将P1代混合细胞以8000‑10000个/cm2接种到培养瓶中，加入完全培养基，按总体积加入0.1％的D液，摇匀后放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％‑90％时收集细胞，得到P2代混合细胞；所述完全培养基为用于间充质干细胞培养的无血清培养基；所述D液的制备方法为：将脐带血放入离心管于4‑8℃的环境中静置3小时后离心，取淡黄色上清液于4℃的温度环境保存备用，标记该液为D液；将P2代混合细胞以8000‑10000个/cm2接种到培养瓶中，加入完全培养基，按总体积加入0.1％的D液，摇匀后放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％‑90％时收集细胞，得到P3代混合细胞；将P3代混合细胞以8000‑10000个/cm2接种到培养瓶中，加入完全培养基后放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％‑90％时收集细胞，得到P4代混合细胞；将P4代混合细胞以8000‑10000个/cm2接种到培养瓶中，加入完全培养基后放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％‑90％时收集细胞，得到P5代混合细胞，并将P5代混合细胞以1×108个/mL收集冻存；对P5代混合细胞进行检测、鉴定，合格的P5代混合细胞即为可用于同源异体移植的间充质干细胞。