[发明专利]一种药用野生稻茎尖的超低温保存及恢复培养方法

摘要

本发明涉及一种药用野生稻带茎尖幼芽超低温保存及再生植株方法，具体的说，涉及一种药用野生稻带茎尖幼芽的超低温保存方法。属植物细胞工程技术领域，超低温保存及再生植株的方法包括如下步骤：1.田间取样及组培体系建立；2.内生菌的检测；3.丛生芽的诱导；4.丛生芽的预培养；5.丛生芽的包埋；6.丛生芽的装载及玻璃化的处理；7.冷冻及解冻洗涤；8.恢复培养。本发明首次提出对药用野生稻带茎尖幼芽成功进行超低温保存，保存后野生稻恢复生长状况良好。对野生稻及禾本科植物的超低温保存具有很好的参考价值。

主权项

1.一种药用野生稻茎尖的超低温保存方法，包括如下步骤：步骤一.田间取样及组培体系建立：取根状茎，冲去根部附着泥沙， 用1%多菌灵浸泡1小时后，在清水培养10‑20天，取地上部分新萌生的气生芽；常规消毒后接种，每30天继代1次;步骤二.内生菌检测：将组培苗转移到含10 g L‑1葡萄糖和5 g L‑1酵母提取物的培养基中培养7‑10天，选取未污染的组培苗进接种到含BA及NAA的培养基上，每30天继代1次;步骤三.丛生芽诱导：取继代30天的无菌组培苗无菌组培苗，剥取2‑3mm茎尖，放入含TDZ0.5‑5mgL‑1 的MS 培养基中，约5‑7天诱导出2‑3mm的丛生芽；步骤四.丛生芽预培养：将丛生芽带基部转入含蔗糖0.3molL‑1及ABA0.5‑5mgL‑1的培养基上培养1‑3天后，转入0.7molL‑1及ABA0.5‑5mgL‑1的培养基上预培养1‑3天;步骤五.丛生芽包埋：解剖镜下切取2‑3mm的芽，在2‑4%的无钙离子海藻酸钠溶液中轻蘸，整齐放在5mm×20mm金属网状装载条上，每条装载条上5‑10个芽，将带芽的装载条浸入含有0.1‑0.3%氯化钙、0.4 molL‑1蔗糖及2moL‑1甘油的MS液体培养基（不含NH4+）中，经10‑30min固定后，将装载条在无菌滤纸上吸去多余液体；步骤六.丛生芽装载及玻璃化处理：将固定好的带芽的装载条放于预处理溶液中装载16hr后转入玻璃化保护剂PVS2（不含NH4+）中进行2‑5hr的冰浴处理；步骤七.冷冻及解冻洗涤：将带芽的装载条迅速投入液氮中保存。