[发明专利]一种制备P2X7R免疫原的方法

摘要

本发明公开了一种制备P2X7R免疫原的方法，对P2X7R蛋白胞外段氨基酸序列进行优化，采用全基因合成并通过限制性酶切位点NdeI和HindIII将P2X7R胞外段基因编码序列插入到表达载体pET30a中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性；将构建好的含有P2X7R胞外段基因编码序列蛋白表达重组质粒转化到BL21表达菌株中并进行IPTG诱导表达，上清中亲和层析纯化P2X7R蛋白并进行检测。本发明的有益效果是能够获得免疫原性P2X7R胞外段，用于P2X7R抗体制备。

主权项

1.一种制备P2X7R免疫原的方法，其特征在于按照以下步骤进行：步骤1：对P2X7R蛋白胞外段氨基酸序列进行优化，采用全基因合成并通过限制性酶切位点NdeI和HindIII将P2X7R胞外段基因编码序列插入到表达载体pET30a中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性；步骤2：将构建好的含有P2X7R胞外段基因编码序列蛋白表达重组质粒转化到BL21表达菌株中并进行IPTG诱导表达，将含有重组质粒的BL21菌种接种到4mL的LB培养基中，待培养至OD600为0.5‑0.8，向试管培养液中加入终浓度0.2mM IPTG，之后分别置于15℃、37℃诱导表达，取诱导后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS‑PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳，电泳后取出凝胶用考马斯亮蓝染色液染色，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰；步骤3：(1)上清中亲和层析纯化P2X7R蛋白；全菌采用20mM PB，300mM NaCl，20mM Imidazole含1％Triton X‑100，1mM DTT，1mM PMSF超声裂解，同时以20mM PB，300mM NaCl，20mM Imidazole缓冲液平衡Ni‑IDA亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS‑PAGE分析检测；(2)包涵体通过亲和层析纯化P2X7R蛋白；包涵体采用20mM PB，300mM NaCl含1％Triton X‑100，5mM DTT洗涤后，以20mM PB，300mM NaCl，8M Urea，20mM Imidazole，1mM DTT缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni‑IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS‑PAGE分析检测。