[发明专利]一种巢式PCR检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法在审

专利信息
申请号: 201811075543.4 申请日: 2018-09-14
公开(公告)号: CN109306372A 公开(公告)日: 2019-02-05
发明(设计)人: 田国忠;姜海;朴东日;赵鸿雁;杨晓雯 申请(专利权)人: 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
主分类号: C12Q1/6848 分类号: C12Q1/6848;C12Q1/04;G16B40/00;C12R1/01
代理公司: 北京思海天达知识产权代理有限公司 11203 代理人: 张立改
地址: 102206 *** 国省代码: 北京;11
权利要求书: 查看更多 说明书: 查看更多
摘要: 一种巢式PCR检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法,涉及分子生物学技术领域。本发明巢式PCR技术,既可检测和鉴定纯菌核酸DNA,也可以检测和鉴定组织液和血液等微量布鲁氏菌核酸DNA;不仅可以鉴定待测标本核酸DNA的布鲁氏菌种型,也可以鉴定其生物型。巢式PCR结果分析可以标准化,试验操作简单,具有普通PCR技术的人员就可以完成。
搜索关键词: 布鲁氏菌 巢式PCR 检测 分子生物学技术 菌核 标本核酸 结果分析 试验操作 核酸DNA 可检测 组织液 标准化 血液
【主权项】:
1.一种巢式PCR检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)待检测样品核酸DNA的提取;(2)引物对的设计:应用软件分别设计布鲁氏菌特异性巢式PCR引物,具体的引物序列包括如下:第一次PCR扩增引物:正向引物:SEQ ID NO:1;反向引物:SEQ ID NO:2;第二次PCR扩增引物:正向引物:F2:SEQ ID NO:3;反向引物:R2:SEQ ID NO:4;(3)以步骤(1)提取的核酸DNA为模板,利用SEQ ID NO:1‑2所示引物,通过PCR反应第一次扩增模板核酸DNA,得到第一次PCR产物的核酸DNA;利用SEQ IDNO:3‑4所示引物,通过PCR反应第二次扩增第一次PCR产物的核酸DNA;(4)检测并分析PCR扩增产物;反应结束后,进行1%的琼脂糖凝胶电泳;所述的1%的琼脂糖凝胶为琼脂糖:凝胶的质量体积比为0.01g/ml;PCR产物经90V电压,1%琼脂糖凝胶电泳1h后,进行凝胶成像分析。若电泳结果被检样品第二次PCR扩增出大小为665‑667bp的目的条带,表明该样品中布鲁氏菌核酸DNA阳性;若电泳结果被检样品第二次PCR扩增未有条带的,表明被检样品不存在布鲁氏菌核酸DNA;(5)PCR产物测序:测序引物为正向引物F2和反向引物R2,双向测序,测通为止;(6)对步骤(5)测序核苷酸序列进行分析确定种型或生物型。
下载完整专利技术内容需要扣除积分,VIP会员可以免费下载。

该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,未经中国疾病预防控制中心传染病预防控制所许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服

本文链接:http://www.vipzhuanli.com/patent/201811075543.4/,转载请声明来源钻瓜专利网。

同类专利
  • 增强恒温扩增核酸灵敏度的方法及其试剂-201910414614.7
  • 程奇;黄震巨;邱宪波;张建勋 - 杭州众测生物科技有限公司
  • 2019-05-17 - 2019-11-05 - C12Q1/6848
  • 本发明公开了一种磁性钢珠用来增加RAA恒温扩增灵敏度的方法及其在核酸分析及检测、医学诊断中的应用,属于生物医学工程领域。其中包括(1)磁性珠的材料选择、(2)磁性钢珠的直径优化、(3)磁性钢珠的混合时间的优化、(4)磁性钢珠对RAA恒温检测灵敏度增加检测方式,其中磁性珠的材料选择为钢性,磁珠的直径选择为1.5mm,磁性钢珠的混合时间30s,恒温RAA结果的检查方式可以为琼脂糖凝胶、荧光检测,在此条件下磁性钢珠对RAA恒温扩增的灵敏度提高了10倍相对于未加钢珠,提高了100倍相对于其他类型的荧光检测仪。本发明磁性钢珠能够显著提高RAA恒温扩增的灵敏度,使得其在核酸快速检测、临床诊断上有较大的应用场景。
  • 一种用于核酸扩增产物防污染检测的CRISPR试剂体系的储存方法及检测管-201910460153.7
  • 吴坚;钱程 - 浙江大学
  • 2019-05-30 - 2019-08-23 - C12Q1/6848
  • 本发明提供了一种用于核酸扩增产物防污染检测的CRISPR试剂体系的储存方法,利用糖分子作为稳定剂与CRISPR试剂体系混合,通过玻璃化处理使之呈薄膜状,并粘附在反应管盖内壁上,实现长期保存。本发明还提供了一种可以长期稳定储存的CRISPR试剂的核酸扩增反应的检测管,采用核酸扩增反应的反应管并设置有管盖,所述管盖内部贴附有CRISPR试剂玻璃化并干燥后形成的膜。本发明在避免核酸扩增后二次开盖的同时,使CRISPR试剂在保证其效力的情况下稳定的与核酸扩增体系共存于同一反应管内。通过这种方式,可以实现试剂在室温下长时间的稳定储存,摆脱了现配现用带来的繁琐操作。
  • 一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法-201611249322.5
  • 刘裴清;李本金;丁雪玲;翁启勇;王荣波;陈庆河 - 福建省农业科学院植物保护研究所
  • 2016-12-29 - 2019-07-19 - C12Q1/6848
  • 本发明提供一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法。本方法通过设计西瓜果斑病菌VapB特异性引物,以样品DNA为模板,利用上述通用引物进行第一轮PCR扩增,再以第一轮PCR产物为模板,利用两对西瓜果斑病菌特异性引物VapB‑1F/VapB‑1R和VapB‑1F/VapB‑2R进行第二轮PCR扩增,扩增产物进行电泳检测,如果出现175bp的特异条带,则确定所检测的病原菌为西瓜果斑病菌。本发明克服了生物学鉴定、酶联免疫技术和常规PCR等方法的缺点,提供了特异性快速、灵敏、特异的西瓜果斑病菌检测方法,可用于西瓜果斑病菌的早期诊断,对该病害的预防和及时防治具有十分重要的意义。
  • 核酸的检测方法-201780066203.2
  • 关口翔太;中川舞;伊藤正照;泽田慎二郎 - 东丽株式会社
  • 2017-11-10 - 2019-07-16 - C12Q1/6848
  • 一种核酸的检测方法,是检测核酸的方法,其包含以下工序:工序a),将包含羧酸和/或其盐的溶液、氧化铈载体和包含核酸的试样混合,使该核酸吸附于氧化铈载体的工序;工序b),从在工序a)中混合后的混合物中分离吸附有上述核酸的氧化铈载体的工序;工序c),在工序b)中分离出的吸附有核酸的氧化铈载体中加入洗脱液来回收核酸的工序;工序d),通过杂交反应或核酸的扩增反应来检测在工序c)中回收的核酸的工序。
  • 一种检测NF1基因外显子基因突变的引物及方法、试剂盒-201910358035.5
  • 潘轶;沈小波 - 明码(上海)生物科技有限公司
  • 2019-04-30 - 2019-07-09 - C12Q1/6848
  • 本发明公开了一种用于检测NF1基因外显子基因突变的引物,包括:5对长片段PCR引物和18对巢式引物;所述5对长片段PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~10所示;所述18对巢式引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11~46所示。本发明还提供了包含上述引物的试剂盒以及采用上述引物检测NF1基因外显子基因突变的方法。本发明所公开的引物覆盖了NF1基因第9‑10,15‑29,32‑36号外显子区域,为NF1基因中主要的存在同源基因的区域,该引物用于检测NF1基因能够解决检测NF1基因该区域外显子突变的问题,且不受NF1基因的突变多样性以及基因组其他同源区域基因突变的影响,提供了一种可靠性高,方便快捷,成本低廉的方法。
  • 一种RT-PCR一步法扩增试剂盒抗产物污染的方法-201610768052.2
  • 张晓玮 - 广州维伯鑫生物科技有限公司
  • 2016-08-30 - 2019-07-09 - C12Q1/6848
  • 本发明公开了一种RT‑PCR一步法扩增试剂盒抗产物污染的方法,该方法为将现有一步法RT‑PCR扩增反应体系中加入特定的化学修饰的dUTP、dATP、dCTP、dGTP,以及UNG酶;同时将未经修饰的dTTP、dATP、dCTP、dGTP的终浓度均降至200nM以下,其他操作均同现有一步法RT‑PCR。本发明方法在一步法RT‑PCR扩增中,不仅具有很好的除产物污染效果,同时也保证了RT‑PCR的灵敏度,而现有防污染方法会明显降低RT‑PCR的灵敏度,影响实验的检测结果。本发明方法的灵敏度与常规的无抗污染体系的灵敏度接近,可以达到普通一步法RT‑PCR的检测效果和灵敏度,并不会降低PCR的灵敏度。
  • 用于扩增核酸的方法和用于实施其的试剂盒-201780065539.7
  • D.谢尔卡索夫;N.巴斯勒;C.贝克尔;H-J.赫斯;A.米勒-赫尔曼 - AGCT有限公司
  • 2017-08-21 - 2019-06-07 - C12Q1/6848
  • 公开了一种扩增核酸的方法,其中基本上利用如下事实:在靶序列特异性激活物寡核苷酸的存在下可倍增/扩增预定义的核酸链(靶序列)。靶序列特异性激活物寡核苷酸通过链置换导致再生的互补引物延伸产物的分离,使得新的引物寡核苷酸可附接至相应的模板链。由此形成的引物寡核苷酸和模板链的复合物可引发新的引物延伸反应。由此形成的引物延伸产物又起模板的作用,从而产生指数扩增反应。这里,激活物寡核苷酸本身不起模板的作用,并且优选对引物延伸反应呈惰性。激活物寡核苷酸在反应中起辅助因子的作用,其再生反应所需模板的相关链区段的单链状态。通过使用包含至少一种引物寡核苷酸、至少一种聚合酶、一组聚合酶底物(例如dNTP)和至少一种特异性激活物寡核苷酸的一组组分,待扩增的核酸可被线性地扩增。通过使用此类组和第二引物寡核苷酸,可呈指数地扩增待扩增的核酸,其中得到的特异性引物延伸产物作为模板用于进一步的引物延伸反应。
  • 一种快速检测水体中小瓜虫的方法-201610024984.6
  • 李莎;刘雪清;姜伟;杨元金;郭柏福 - 中国长江三峡集团公司中华鲟研究所
  • 2016-01-15 - 2019-05-10 - C12Q1/6848
  • 本发明涉及一种快速检测水体中小瓜虫的方法,根据养殖水域大小,采集水样;水样进行处理后,提取水体中的总DNA;利用已知核苷酸序列IC‑ITS‑F 5'‑GTTCCCCTTGAACGAGGAATTC‑3'和IC‑ITS‑R 5'‑TTAGTTTCTTTTCCTCCGC‑3’作为引物进行PCR扩增,得到PCR产物,将上述PCR产物连接载体后转入大肠杆菌DH5α中进行克隆,利用DNAMAN6.0软件对测序结果进行比对后,查找小瓜虫与其它可测得的相似种之间的差异位点并设计出针对小瓜虫的巢氏PCR引物,利用引物对第一次PCR产物进行巢氏PCR,电泳检测结果显示,有小瓜虫可扩增出条带,即可完成检测。采用该方法十分简便高效的检测了水体中小瓜虫的存在情况,为及时进行水体处理,防止小瓜虫的爆发提供了有效途径,极具实用价值,值得推广。
  • 一种快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查方法-201910066443.3
  • 吴坚;钱程 - 浙江大学
  • 2019-01-24 - 2019-05-03 - C12Q1/6848
  • 本发明提供了一种快速可视化且可防止气溶胶污染的核酸现场检查方法,它将核酸扩增反应液置于反应管中,在核酸扩增反应液上覆盖油相层,进行核酸扩增反应,在核酸扩增反应结束后,在有油相层覆盖在核酸扩增液表明的情况下,将合适体积的CRISPR体系加入反应管,通过离心作用,使核酸扩增子和CRISPR体系混合并进行反应,待反应到一定程度后,在紫外灯照射下,利用肉眼观察或摄像设备观察反应管,如果有荧光,则检查结果为阳性,否则为阴性。本发明利用CRISPR体系结合核酸扩增技术,实现对目标物进行快速特异性的可视化检测,并且在检测过程中可以避免由于添加CRISPR体系带来的气溶胶污染问题。
  • 一种基于巢式复合COLD-PCR的T790M突变检测方法-201610075841.8
  • 罗凯;贺智敏;王倩;张志杰;郑国沛;仇秦威;刘浩;邱霓 - 广州医科大学附属肿瘤医院
  • 2016-02-03 - 2019-04-30 - C12Q1/6848
  • 本发明公开了一种基于巢式复合COLD‑PCR联合测序的T790M突变检测方法。该方法以待测样本核酸为模板,利用SEQ ID NO.1~4和SEQ ID NO.5~8所示的引物组进行巢式复合COLD‑PCR联合测序。巢式复合COLD‑PCR包括外反应和内反应,外反应是COLD‑PCR与常规PCR反应的组合反应,内反应是常规PCR反应。该方法具有很好的突变检测灵敏度、检测下限和重复性,而且可无差别扩增野生型与突变型样品且同样具有突变富集效果,还可通过调整外反应的循环数比,根据需要调整突变富集效果和检测灵敏度,具有非常好的应用前景。
  • 用于超灵敏检测人类KRAS基因12/13密码子突变的引物、检测方法及试剂盒-201710807099.X
  • 陈渊能 - 广州健天基因技术有限公司
  • 2017-09-08 - 2019-03-19 - C12Q1/6848
  • 本发明提供了用于超灵敏检测人类KRAS基因12/13密码子突变的引物、检测方法及试剂盒。本发明提供的检测引物能与KRAS基因的特异序列结合,扩增突变序列。本发明提供的检测荧光信号基团能与扩增片段结合发出荧光信号,利用阻断剂与突变位点对应的野生型序列特异结合,抑制野生型非特异性扩增。本发明采用竞争性等位基因特异性PCR扩增技术,建立基于实时荧光PCR的试剂盒,可准确检测KRAS基因突变。本发明方法操作简单,结果易读;灵敏度高,能检出含0.001%KRAS基因的样本,实现对KRAS基因突变的超灵敏检测。
  • 普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用-201811322094.9
  • 关一夫;高雪芹 - 中国医科大学
  • 2018-11-08 - 2019-03-19 - C12Q1/6848
  • 一种普鲁兰多糖用于提高核酸扩增特异性的应用。所述应用中将普鲁兰多糖与DNA聚合酶、扩增引物、dNTP、Mg2+、扩增模板或待测的靶核酸分子、报告分子中的一种或多种组合成试剂。所述核酸扩增特异性中的核酸扩增方法为热循环扩增方法或等温扩增方法。本发明提出了利用普鲁士多糖来改善等温扩增特异性的创意,并得到了实验验证。
  • 一种儿童癫痫的诊断试剂盒及其检测方法-201811364911.7
  • 张接军;张鹏飞;张艺飞 - 昆明新开源暾秀生物科技有限公司
  • 2018-11-14 - 2019-02-15 - C12Q1/6848
  • 本发明公开了一种儿童癫痫的诊断试剂盒及其检测方法,其中,所述诊断试剂盒包括SNP位点的两对上下游扩增引物及扩增模板提取试剂、DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液,所述SNP位点为miR‑146a的SNP位点,第一轮扩增产物长于第二轮扩增产物且包含第二轮扩增产物,第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板进行。采用两轮扩增的方法对同一段片段进行重复扩增,第二轮引物结合在第一次PCR产物内部,使得第二次PCR扩增片断短于第一次扩增,由于第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低,因此两轮扩增可以很好地修正第一次扩增中产生的错误片断,扩增的特异性非常高,基本杜绝了引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。
  • 通过容错性扩增解决等位基因扩增不平衡的方法-201710158920.X
  • 刘湘;王雷;赵晓丹;兰更欣;张兴鹏;宋晓玲;张少影 - 北京博奥晶典生物技术有限公司;成都博奥晶芯生物科技有限公司
  • 2017-03-16 - 2019-01-15 - C12Q1/6848
  • 本发明公开了一种通过容错性扩增解决等位基因扩增不平衡的方法。该方法针对由于“在待测等位基因的引物与模板结合区存在碱基序列不匹配情况”而导致的等位基因扩增不平衡的情况,包括如下:改变原有PCR扩增条件来增强PCR扩增时引物的容错性。该方法可有效解决由于“在待测等位基因的引物与模板结合区存在碱基序列不匹配情况”而导致的等位基因扩增不平衡,重要优点是,对类似HLA的复杂基因进行PCR扩增时,即使引物序列上出现新的未知的多态性位点时,也能较好的进行扩增,减少等位基因扩增不平衡,有效避免其中一个等位基因扩增失败而导致的检测错误,而且还避免了针对引物结合区存在不同多态性位点时,需设计大量不同序列匹配引物进行扩增的难题。
  • 引物5’端反向互补的荧光PCR-201810544265.6
  • 江洪;江和来 - 江洪
  • 2018-05-31 - 2018-11-13 - C12Q1/6848
  • 引物5'端反向互补的荧光PCR,属于分子生物学‑核酸扩增技术领域,其特征是一对引物5'端添加一段序列反向互补的荧光PCR扩增,带来扩增产物间末端互补,靶产物3'末端也可以互为模板、互为引物而增加扩增效率,在常规PCR指数放大109‑12基础上再增加灵敏度50倍,或同样灵敏度情况下可少扩增5个循环;另一面引物5'端互补不会延伸反而抑制原引物对3'末端间的聚合非特异性或少扩增5个循环可避开引物非特异扩增区。联合中部同序与3'最末端倒数第1‑2个碱基A腺嘌呤结尾的引物+UDG酶解dU代替dT的扩增产物,和矿物油密闭使PCR反应循环内无引物二聚体PD产生及杜绝产物气雾胶交叉污染。
  • 一种转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法-201410778521.X
  • 王丽娟;方雪恩;陈旭;徐凌佳;孔继烈 - 上海速芯生物科技有限公司;复旦大学
  • 2014-12-16 - 2018-11-09 - C12Q1/6848
  • 本发明公开了一种转基因大豆及其衍生品种的Arm‑PCR检测方法,转基因大豆及其衍生品种为转基因大豆GTS40‑3‑2、Mon89788、A5547‑127及其衍生品种,其Arm‑PCR检测引物组包括内参Lectin引物组、特异性的套式PCR引物、超级上游引物Fs和超级下游引物Rs,特异性的套式PCR引物用于Arm‑PCR的第一步扩增,超级上游引物Fs和超级下游引物Rs用于Arm‑PCR的第二步扩增,检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照,采用六对套式引物和一对超级引物,在DNA聚合酶的作用下,对DNA模板进行扩增,用毛细管电泳检测扩增结果。本发明具有低成本、快速、高通量和阳性检出率高等优势,并具有兼容性、特异性、敏感性、半定量性、灵活性、重复性和高效性。
  • 防止扩增过程中高分子量产物的方法-201310492172.0
  • R.巴比尔;F.贝格曼;D.西茨曼 - 霍夫曼-拉罗奇有限公司
  • 2013-10-18 - 2018-09-21 - C12Q1/6848
  • 本发明涉及用于扩增和检测可存在于生物样品中的核酸目标的改进的方法,包含用于产生扩增子的引物对和对于所述扩增子特异性的可检测的探针或DNA结合染料,其中至少一个引物在5’末端用与目标序列不互补的聚N序列修饰。防止或部分或完全抑制在扩增过程中的高分子量产物的形成。本发明进一步提供适当修饰的引物和包含所述引物的试剂盒用于防止或抑制在核酸目标的扩增和检测过程中的高分子量产物形成的用途。
  • 一种检测人EGFRT790M位点的巢式微滴数字PCR特异引物和探针及其应用-201810435532.6
  • 姜国忠 - 郑州炽能生物科技有限公司
  • 2018-05-09 - 2018-08-17 - C12Q1/6848
  • 本发明公开了一种检测人EGFR T790M位点的巢式微滴数字PCR特异引物和探针及其应用,组合包括一对内测引物,一对外侧引物,检测T790M位点的突变型探针和野生型探针。利用这个特异引物和探针组合,通过巢式微滴数字PCR实现了对人EGFR基因T790M位点的高灵敏度的精确检测,尤其是在肺癌患者中的检测。本发明可进一步用于多种来源的样本,以及肺癌检测试剂盒或肺癌检测设备中的应用,为临床药物应用,病情检测和预后提供重要的参考依据。
  • 一种巢式PCR检测试剂盒及其在黄栌枯萎病菌检测中的应用-201810463409.5
  • 周江鸿;夏菲;车少臣 - 北京市园林科学研究院
  • 2018-05-15 - 2018-07-24 - C12Q1/6848
  • 本发明提供了一种巢式PCR检测试剂盒,所述试剂盒包括:用于第一轮PCR扩增的引物P1和引物P2;和用于第二轮PCR扩增的引物PN1和引物PN2;所述引物P1、P2、PN1和PN2在PCR扩增反应中分别具有与SEQ ID NO.1至4相同或相似的扩增功能。本发明还提供所述试剂盒在检测黄栌枯萎病菌(Verticillium dahliae)中的应用。本发明还提供了一种利用所述试剂盒来检测黄栌枯萎病菌的方法。本发明可以高灵敏度、高准确度快速地检测黄栌枯萎病菌。
  • 用于核酸等温扩增的改进方法-201711179875.2
  • 克里斯蒂安·科哈格 - 凯杰有限公司
  • 2011-08-09 - 2018-04-06 - C12Q1/6848
  • 本发明公开了用于核酸等温扩增的改进方法,所述方法包括在预定条件下从基质释放出必要组分的步骤。此外,本发明涉及试剂盒,所述试剂盒包含嗜中温酶和包埋有用于等温扩增的必要组分的基质。本发明还公开了包含基质和嗜中温酶的组合物,和用于包埋嗜中温酶的方法。
  • 一种检测大花蕙兰瘤菌根菌和/或矮伞形霉的试剂盒及方法-201610573577.0
  • 赵小兰;刘敏;邓丹丹 - 华南农业大学
  • 2016-07-19 - 2018-03-20 - C12Q1/6848
  • 本发明公开一种检测大花蕙兰瘤菌根菌和/或矮伞形霉的试剂盒及方法。该试剂盒包含如SEQ ID NO.3~10所示的引物。本发明的方法采用前述试剂盒实现以待检测样品的基因组DNA为模板,以正向外引物和反向外引物为引物对进行第一次PCR扩增,得到的PCR产物为模板,以正向内引物和反向内引物为引物对进行第二次PCR扩增,得到的PCR产物进行检测;当使用SEQ ID NO.3~6所示的引物,扩增得到435bp条带,表明待检测样品中存在瘤菌根菌;当使用SEQ ID NO.7~10所示的引物,扩增得到195bp条带,表明待检测样品中存在矮伞形霉。本发明适用于检测栽培条件下的瘤菌根菌及矮伞形霉,特异性强。
专利分类
×

专利文献下载

说明:

1、专利原文基于中国国家知识产权局专利说明书;

2、支持发明专利 、实用新型专利、外观设计专利(升级中);

3、专利数据每周两次同步更新,支持Adobe PDF格式;

4、内容包括专利技术的结构示意图流程工艺图技术构造图

5、已全新升级为极速版,下载速度显著提升!欢迎使用!

请您登陆后,进行下载,点击【登陆】 【注册】

关于我们 寻求报道 投稿须知 广告合作 版权声明 网站地图 友情链接 企业标识 联系我们

钻瓜专利网在线咨询

400-8765-105周一至周五 9:00-18:00

咨询在线客服咨询在线客服
tel code back_top