[发明专利]一种条件性细胞永生化慢病毒载体及其构建方法和在猪卵巢颗粒细胞建系中的应用

摘要

本发明公开了一种条件性细胞永生化慢病毒载体的构建方法，本发明还公开了用该种慢病毒载体包装所获得的pLVX‑Tet3G‑Large T‑T2A‑mCherry‑Puro^r慢病毒及其在猪卵巢颗粒细胞建系中的应用。本发明首次通过Tet‑on‑3G系统建立可逆型和可诱导的猪卵巢颗粒细胞系，该细胞系具有可诱导和反转的特征。当添加Dox时，可以在体外稳定维持细胞增殖；当去除Dox时，卵巢颗粒细胞可以分化成功能的终末细胞，分泌更多雌激素和孕激素，但这时丧失了增殖能力；当再次添加Dox时，细胞仍会重新回归到增殖状态。该可逆型细胞系对于研究细胞增殖，分化和去分化具有重要的意义，同时根据卵巢颗粒细胞生物学性质，本发明的细胞系在对于研究卵巢颗粒细胞激素分泌和卵母细胞发育调控具有重要应用价值。

主权项

1.一种条件性细胞永生化慢病毒载体的构建方法，其特征在于包括步骤：1)根据分子克隆技术，双酶切Tet‑on‑3G慢病毒载体，回收7595bp载体片段；2)利用引物1和引物2，以pLVX‑Large T‑EF1‑EGFP为模板扩增获得Large T‑T2A片段，所述引物1和引物2的序列如SEQ ID NO1和2所示；利用引物3和引物4，以pLVX‑sgRNA‑mCherry为模板扩增获得T2A‑mCherry片段，所述引物3和引物4的序列如SEQ ID NO3和4所示；3)以步骤2)所得Large T‑T2A片段和T2A‑mCherry片段为模板，添加引物1和引物4，进行重叠PCR扩增，获得LargeT‑T2A‑mCHRRY的DNA片段，双酶切，回收；4)通过连接酶把步骤3)所得LargeT‑T2A‑mCHRRY连入Tet‑on‑3G慢病毒载体中，即构建获得pLVX‑Tet3G‑Large T‑T2A‑mCherry‑Puror慢病毒。