[发明专利]利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌及构建方法

摘要

本发明公开了一种利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌及构建方法，通过同源重组的方法，将酿酒酵母木酮糖激酶基因XKS1的启动子置换为启动子PFBA1，再导入木糖还原酶XYL1、木糖醇脱氢酶XYL2表达盒，再提高转酮酶TKL1和转醛酶TAL1活性，得到重组菌1，再向重组菌1中导入法呢酰二磷酸酯法呢酰基转移酶基因ERG9、鲨烯单加氧酶基因ERG1和达玛烯二醇合酶基因DS，得到重组菌2，向重组菌2中导入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸‑羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因NADH‑HMGr、法呢基焦磷酸合酶ERG20、原人参二醇合酶‑细胞色素P450还原酶融合蛋白基因PPDS‑ATR1，得到重组菌3，本发明的重组酿酒酵母菌利用木糖人工合成达玛烯二醇和原人参二醇。

主权项

1.利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌构建方法，其特征是包括如下步骤：(1)通过同源重组的方法，将酿酒酵母内源的木酮糖激酶基因XKS1的启动子置换为启动子PFBA1，再向酿酒酵母的δ位点导入木糖还原酶基因XYL1表达盒和木糖醇脱氢酶基因XYL2表达盒，得到重组菌；再向重组菌的rDNA位点导入磷酸戊糖途径中转醛酶基因TAL1表达盒和转酮酶基因TKL1表达盒，得到代谢木糖的重组酿酒酵母菌1；所述启动子PFBA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；木糖还原酶基因XYL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；木糖醇脱氢酶基因XYL2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；转醛酶基因TAL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；转酮酶基因TKL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；(2)通过同源重组的方法，向所述代谢木糖的重组酿酒酵母菌1的rDNA位点导入法呢酰二磷酸酯法呢酰基转移酶基因ERG9表达盒、鲨烯单加氧酶基因ERG1表达盒和达玛烯二醇合酶基因DS表达盒，得到代谢木糖的重组酿酒酵母菌2；法呢酰二磷酸酯法呢酰基转移酶基因ERG9的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；鲨烯单加氧酶基因ERG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；达玛烯二醇合酶基因DS的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；(3)通过同源重组的方法，向代谢木糖的重组酿酒酵母菌2的δ位点导入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸‑羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因NADH‑HMGr表达盒、法呢基焦磷酸合酶基因ERG20表达盒、原人参二醇合酶‑细胞色素P450还原酶融合蛋白基因PPDS‑ATR1表达盒，得到利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌3；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸‑羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因NADH‑HMGr的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；法呢基焦磷酸合酶基因ERG20的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；原人参二醇合酶‑细胞色素P450还原酶融合蛋白基因PPDS‑ATR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。