[发明专利]一种转化药用野生稻cDNA文库改良水稻品种的方法

摘要

本发明公开了一种转化药用野生稻cDNA文库改良水稻品种的方法，涉及分子生物学领域。本发明通过构建药用野生稻的cDNA文库，并通过农杆菌介导转化进入水稻基因组中，高通量改良水稻品种，在获得的转基因系中筛选具有优良基因特性的个体，转基因系与野生型相比，在株高，分蘖、抽穗期、抗病虫害、耐寒性方面均呈现出明显的变化，考种分析显示部分水稻转基因系与产量提升相关。本发明具有时间短、效率高、水稻突变性状丰富。对出现变化的水稻植株进行转基因验证分析，遗传背景明确，筛选可利用的优良基因用于后续水稻靶向改良。

主权项

1.一种转化药用野生稻cDNA文库改良水稻品种的方法，其特征在于，包含以下操作步骤：(1)药用野生稻cDNA文库的构建；(2)药用野生稻cDNA文库序列分析：将E.coil药用野生稻cDNA库中50个随机单克隆测序分析，将测序序列上传到NCBI数据库进行药用野生稻基因BLAST分析，记录相关匹配的信息如匹配的基因登录号、百分数、CDS(coding sequence)、基因注释等，进行cDNA完整性分析和ORF预测；(3)E.coli药用野生稻cDNA文库大规模质粒抽提：(3.1)挑取单菌落于带有相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃，250rpm振荡培养20h；(3.2)5mL培养物分3次倒入1.5mL微量离心管中，用微量离心机于4℃，12000rpm离心30s吸去上清再倒入1.5mL的培养物再沉淀细菌；(3.3)向离心管中加入180μL的预冷的Solution 1用旋涡震荡器重悬沉淀；(3.4)加入360μL新配制的Solution 2盖紧管口，迅速颠倒离心管6～10次，冰上放置10～15min；(3.5)加入270μL预冷的Solution 3轻轻混匀，冰上静置20min；(3.6)用微量离心机于4℃以下离心5min，将上清转移到另一离心管中，加等体积的苯酚：氯仿(1：1)，振荡混匀，用微量离心机于4℃以12000rpm离心l0min，将上清转移到另一离心管中；(3.7)向上清中先加入1/10倍体积的醋酸钠再加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，‑20℃低温放置15min；(3.8)用微量离心机于4℃以12000离心5min弃上清，用70％乙醇洗1～3次，沉定于空气中干燥l0min,用20μL TE buffer溶解质粒DNA加入1μL 10mg/mL RNaseA后用Nanodroping测定质粒的浓度备用；(4)农杆菌感受态细胞的制备，方法如下：挑取农杆菌单菌落接种于5mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，28℃，250rpm培养12h；吸取2mL培养物转入50mL YEB液体培养基，继续培养至OD600值为0.5～1.0，将菌液转至无菌离心管中，冰浴30min,5000rpm离心5min；用1.7mL的20mmoL/L无菌CaCl2重悬菌体，再加入300微升无菌甘油，混匀后，按每管200μL分装于无菌0.5mL微量离心管中，‑70℃保存存备用。(5)药用野生稻目的cDNA过表达文库质粒转入农杆菌，方法如下：(A)首先从‑70℃取出农杆菌感受态放置于冰上融解；(B)在200μL的GV3101感受态细胞中加入2mg重组质粒DNA，冰浴5min,然后转至液氮中冷冻8min，迅速于37℃冰浴中温育5min后，加入800μL无抗生素YEB液体培养基，28℃，250rpm预表达培养4h～5h，然后涂铺含有卡那霉素、利福平的YEB平板，28℃培养36h；(C)计数平板上长出的菌落数，挑取单菌落于含有50μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平的YEB液体培养基中摇菌，28℃，250rpm培养12h，5000rpm，离心10min，收集菌体，无菌水洗涤三次后用20％甘油水溶液重悬，‑20℃保存备用；(6)农杆菌介导药用野生稻cDNA转化改良水稻品种：(a)选择颖壳干净明亮的、当年的种子，剥去颖壳，在无菌操作台上将其置入100mL灭菌的锥形瓶中，用灭菌的蒸馏水清洗种子3次，再用75％酒精消毒2次，每次1min，然后用灭菌的蒸馏水洗3次除去酒精以后，用0.15％的升汞消毒15min，期间用手摇动锥形瓶，弃去升汞，用灭菌水清洗种子3次，然后将多余的水分除尽，按每平皿10粒种子将种子接种到B5固体培养基上，封口膜封好，28℃黑暗条件下，培养30天；(b)将黄色胚性愈伤组织接种到新的继代培养基上，28℃避光培养25d，挑选亮黄色、干燥的致密胚性愈伤接种到预培养培养基上，此培养基加有终浓度50μg/mL乙酰丁香酮，28℃黑暗条件下培养4天；(c)将含有药用野生稻cDNA的农杆菌涂布于含有50μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平的YEB固体培养基上，28℃黑暗培养24h，在无菌操作台上，用枪头吸取农杆菌悬浮培养基轻轻吹打含有药用野生稻cDNA的农杆菌，然后再吸取这些溶液加入到50mL农杆菌悬浮培养基中，同时加入50μL，50mg/mL的乙酰丁香酮，标定OD600为0.8，然后加入在AS上生长5天的愈伤组织，42℃条件下热激30min；(d)在无菌操作台上尽量除尽菌液，将愈伤组织摊开置于已经灭菌的带有滤纸平皿上吹风1h，直到愈伤组织表面水分被吹干，随后，将其转移到共培养培养基上，24℃，黑暗下培养5d；(e)在无菌操作台上，将共培养后的愈伤组织放到大小为250mL三角瓶里，用2L灭菌的ddH2O洗5次，用含100μg/mL利福平的无菌双蒸水洗涤2次，每次持续时间15min，用手摇动，然后将愈伤组织摊开在带有无菌滤纸的平皿上进行表面干燥；(f)将上述表面干燥的愈伤组织接种到含有50μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平的筛选培养基上进行筛选，每平皿放置愈伤组织15颗，28℃黑暗条件下培养24天，再将愈伤组织接种到新的含有50μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平筛选培养基上进行第二次筛选，28℃黑暗条件下培养24天；(g)将长出的黄色致密的愈伤组织进行分化，配制分化培养基放置4～6天，然后，将待分化的愈伤组织接种到培养基上，28℃光下生长15～20天，幼苗长至3～5cm，将其移至1/2MS生根培养基上生根；(h)当转基因苗根系足够发达，能够适应土壤生长环境时就可以对其进行炼苗，将其放置于栽培环境中生长3天，然后加无菌ddH2O炼苗4d，将转基因苗从培养基中直接取出并栽培到土壤中；(i)转基因得到的水稻转基因系经过T0代、T1代和T2代的种植和表型观察，筛选优良水稻品系。