[发明专利]一株I型牛疱疹病毒gE缺失毒株及其获取方法

摘要

本发明提供了一株I型牛疱疹病毒gE缺失毒株，属于基因工程技术领域。本发明提供的I型牛疱疹病毒gE缺失毒株为快速制备IBRV基因缺失疫苗的研究奠定基础。

主权项

1.一株I型牛疱疹病毒gE缺失毒株，其特征在于，所述I型牛疱疹病毒gE缺失毒株的获取方法，包括以下步骤：1)以I型牛疱疹病毒基因组为模板，分别利用gE基因上游同源臂引物对和下游同源臂引物对扩增，分别得到gE基因上游同源臂和gE基因下游同源臂；所述gE基因上游同源臂引物对的上游引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述gE基因上游同源臂引物对的上游引物5’端加入酶切位点HindIII后再进行扩增；所述gE基因上游同源臂引物对的下游引物具有SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列，所述gE基因上游同源臂引物对的下游引物5’端加入酶切位点KpnI后再进行扩增；所述gE基因下游同源臂引物对的上游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述gE基因下游同源臂引物对的上游引物5’端加入酶切位点BamHI后再进行扩增；所述gE基因下游同源臂引物对的下游引物具有SEQ IDNo.4所示的核苷酸序列，所述gE基因下游同源臂引物对的下游引物5’端加入酶切位点EcoRI后再进行扩增；2)将所述步骤1)得到的gE基因上游同源臂采用HindIII和KpnI进行双酶切，得到gE基因上游同源臂酶切产物；将所述步骤1)得到的gE基因下游同源臂采用BamHI和EcoRI进行双酶切，得到gE基因下游同源臂酶切产物；3)将所述步骤2)得到的gE基因上游同源臂酶切产物与PCDNA3.1(+)进行连接，得到gE基因上游同源臂连接产物；所述PCDNA3.1(+)质粒是用HindIII和KpnI进行酶切处理后得到；4)将所述步骤3)得到的gE基因上游同源臂连接产物依次进行转化、提取质粒，得到质粒pBHV‑3；5)将所述步骤4)得到的质粒pBHV‑3采用BamHI和EcoRI进行双酶切，得到质粒pBHV‑3酶切产物，将所述质粒pBHV‑3酶切产物与步骤2)得到的gE基因下游同源臂酶切产物进行连接，得到gE基因下游同源臂连接产物；6)将所述步骤5)得到的gE基因下游同源臂连接产物依次进行转化、提取质粒，得到重组质粒pBHV‑1；7)在sgRNA‑1上游引物和sgRNA‑1下游引物的5’端分别加入酶切位点BbsI后进行变性退火延伸，得到sgRNA‑1；所述sgRNA‑1上游引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，所述sgRNA‑1下游引物具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；在sgRNA‑2上游引物和sgRNA‑2下游引物的5’端分别加入酶切位点BbsI后进行变性退火延伸，得到sgRNA‑2；所述sgRNA‑2上游引物具有SEQ IDNo.6所示的核苷酸序列，所述sgRNA‑2下游引物具有SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；8)将pSpCas9‑2A‑Puro经BbsI酶切后，得到pSpCas9‑2A‑Puro酶切产物，将所述pSpCas9‑2A‑Puro酶切产物分别与步骤7)所述的sgRNA‑1和sgRNA‑2连接，得到含有sgRNA‑1的pSpCas9‑2A‑Puro和含有sgRNA‑2的pSpCas9‑2A‑Puro；9)将步骤8)得到的含有sgRNA‑1的pSpCas9‑2A‑Puro和含有sgRNA‑2的pSpCas9‑2A‑Puro分别依次经转化、提取质粒后，得到切割质粒pSpCas9‑2A‑Puro‑1和切割质粒pSpCas9‑2A‑Puro‑2；10)将所述步骤6)得到的重组质粒pBHV‑1与步骤9)得到的切割质粒pSpCas9‑2A‑Puro‑1、切割质粒pSpCas9‑2A‑Puro‑2混合后转染vero细胞，转染5～7h后以MOI为0.1感染I型牛疱疹病毒，1.5～2.5d后得到空白斑，将所述空白斑接种于DMEM液体培养基后进行冻融，将得到的冻融物接种于单层MDBK细胞上进行感染，4h后将得到的感染物接种于含有胎牛血清的培养基中，出现病变后挑取噬斑，得到I型牛疱疹病毒gE缺失毒株；所述重组质粒pBHV‑1与切割质粒pSpCas9‑2A‑Puro‑1、切割质粒pSpCas9‑2A‑Puro‑2的质量比为4:1:1。