[发明专利]PD-1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法

摘要

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种PD‑1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法。PD‑1和CTLA4双基因敲除载体的构建，T淋巴细胞分离与激活，电转染T淋巴细胞及T7E1酶切鉴定，流式细胞仪筛选与测序分析。本发明的基因缺陷型免疫细胞制剂的生产，一方面简化了细胞的生产程序，另一方面提升了T淋巴细胞杀灭肿瘤细胞的能力，并能增强长期肿瘤免疫。

主权项

1.一种PD‑1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤如下：(1)PD‑1和CTLA4双基因敲除载体的构建根据PD‑1和CTLA4全基因序列分别设计gRNA target序列，然后将两个gRNA target序列克隆进表达载体，获得带有两个不同target序列gRNA的敲除载体；两个gRNA target序列分别为5’‑GGAGTGGATAGGCCACGGCG‑3’和5’‑ACACCGCTCCCATAAAGCCA‑3’；(2)T淋巴细胞分离与激活T淋巴细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；(3)电转染T淋巴细胞及T7E1酶切鉴定T淋巴细胞中加入电转液和步骤(1)得到的敲除载体进行电转染，电转染结束后，继续培养，收集细胞提取基因组，采用T7E1酶切鉴定；(4)流式细胞仪筛选与测序分析电转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离得到单克隆细胞，单克隆细胞扩大培养，即得PD‑1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂；扩大培养后的单克隆细胞提取基因组进行测序分析。