[发明专利]一种利用免疫磁珠负向吸附联合流式细胞法检测循环肿瘤细胞的试剂盒的检测方法

摘要

一种利用免疫磁珠负向吸附联合流式细胞法检测循环肿瘤细胞的试剂盒的检测方法；本发明属于细胞生物学检测领域，包括以下具体步骤：红细胞裂解，免疫磁珠负向去除白细胞，细胞染色等，本发明的有益效果是(1)灵敏度高，流式细胞仪可达到十万分之一的灵敏度；(2)特异性强，利用上皮型CTC特异性抗体EPCAM、CK以及间质型CTC特异性抗体N‑Cadherin以及vimentin联合进行CTC的检测，特异性强；(3)细胞计数由流式细胞自动完成，方便操作，结果客观、精确度高；(4)此方法不依赖于肿瘤细胞大小及特异性抗原，采用免疫磁珠负向吸附法富集CTC，所有种类CTC，CTM等异常细胞都会被富集，不会漏检。

主权项

1.一种利用免疫磁珠负向吸附联合流式细胞法检测循环肿瘤细胞的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下具体步骤：1.1、红细胞裂解(1)、抽取7.5ml的外周血留置，另准备22.5ml的红细胞裂解液，将两者共同置于离心管中混匀，将离心管置于4℃环境下放置15分钟，(2)、放置15分钟后，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心10分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为裂解的红细胞溶液，下层为沉淀的白细胞，吸弃上层裂解的红细胞溶液，留置沉淀的白细胞；(3)、向沉淀的白细胞中再加入15ml的红细胞裂解液，将离心管置于涡旋机中涡旋混匀用以重悬白细胞，后再次将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心10分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为新裂解的红细胞溶液，下层为新沉淀的白细胞，吸弃上层新裂解的红细胞溶液，留置新沉淀的白细胞；(4)、向新沉淀的白细胞中加入1ml的磷酸盐缓冲液，后再次将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为第三次裂解的红细胞溶液，下层为第三次沉淀的白细胞，吸弃上层第三次裂解的红细胞溶液，留置第三次沉淀的白细胞；(5)、向第三次沉淀有白细胞的离心管中加入100ul的磷酸盐缓冲液，用以重悬沉淀的白细胞，后搁置离心管；1.2、免疫磁珠负向去除白细胞(1)、计数重悬沉淀后的白细胞的细胞数，并以每106细胞数加入20ul生物素化抗体，将离心管置于4℃温度的冰箱中孵育15分钟后取出；(2)、加入1ml的磁珠缓冲液，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合的生物素化抗体及磁珠缓冲液，下层沉淀为结合了生物素化抗体的白细胞，吸弃上层溶液，留置沉淀的白细胞；(3)、以每106结合了生物素化抗体的白细胞的细胞数中加入5μl的链霉抗生物素蛋白颗粒，将离心管置于4℃温度下放置30分钟；(4)、将离心管中的混合溶液转移到圆底试管中，向圆底试管再加入1ml的磁珠缓冲液，将圆底试管置于细胞分离磁力架中放置8分钟；8分钟后结合了链霉抗生物素蛋白颗粒的细胞被吸附至圆底试管的内壁上，剩余未结合链霉抗生物素蛋白颗粒的细胞溶液，吸附出该细胞溶液并置于1.5ml的离心试管中即为负向吸附后得到的细胞。1.3、细胞染色上述经负向吸附后得到的细胞进行表面抗体染色，向1.5ml的离心试管中按照每106各加入5ul的表面染色抗体充分混匀，将离心试管常温下避光孵育20分钟；向孵育后的细胞中加入1ml的磷酸盐缓冲液，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的表面抗体及磷酸盐缓冲液，下层为沉淀的细胞，吸弃上层的细胞溶液，留置沉淀的细胞；再向离心管中加入250μl的固定缓冲液，混匀后4℃孵育细胞20分钟；将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的固定缓冲液，下层为被固定的细胞；吸附出上未结合细胞的固定缓冲液；再向离心管中添加250ul的破膜剂，涡旋混匀；将离心试管4℃温度孵育30分钟后；将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的破膜剂，下层为破膜后的细胞；吸附出未结合细胞的破膜剂；用100ul磷酸盐缓冲液重悬破膜后的细胞，进行胞内抗体染色，向1.5ml的离心试管中按照每106各加入5ul的胞内染色抗体充分混匀，将离心试管常温下避光孵育20分钟；向孵育后的细胞中加入1ml的磷酸盐缓冲液，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的胞内抗体及磷酸盐缓冲液，下层为沉淀的细胞，吸弃上层的细胞溶液，留置沉淀的细胞；用100ul磷酸盐缓冲液重悬细胞后上流式细胞仪检测。