[发明专利]一种定量检测降钙素原的试剂盒及制备方法

摘要

本发明提供了一种定量检测降钙素原的试剂盒，试剂盒包括：碱性磷酸酶标记的降钙素原的单克隆抗体；生物素标记的降钙素原的单克隆抗体；包被有链霉亲和素的载体；降钙素原校准品；上述碱性磷酸酶所作用的化学发光底物。同时，试剂盒的制备方法包括：用碱性磷酸酶标记降钙素原的单克隆抗体；以生物素标记降钙素原的单克隆抗体；以降钙素原的单克隆抗体包被载体；以降钙素原纯品配制降钙素原校准品；分装上校准品、碱性磷酸酶标记的降钙素原的单克隆抗体、生物素化抗体和化学发光底物；组装为成品。本发明的试剂盒灵敏度高，特异性好，定量检测结果准确度高，使用成本低，更易推广应用。 1

主权项

1.一种定量检测降钙素原的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：碱性磷酸酶标记的降钙素原的单克隆抗体、生物素标记的降钙素原的单克隆抗体、包被有链霉亲和素的载体、降钙素原校准品和化学发光底物。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述载体为固相载体、磁性微粒、微孔板、塑料管或塑料珠。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述载体为磁性微粒，粒径2‑3μm，活性基团为羧基、醛基或磺酸基，使用浓度为2‑5mg/mL。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为1，2‑二氧环已烷衍生物、过氧化氢、过氧化脲。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学底物液包括体积比20%的1，2‑二氧环已烷衍生物，重量比16%的NaCl，重量比0.5%的KCl和0.2M pH 8.0～10.0的Tris‑HCl缓冲液。

6.一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）用碱性磷酸酶标记降钙素原的单克隆抗体；

（2）以生物素标记降钙素原的单克隆抗体；

（3）以链霉亲和素包被载体；

（4）以降钙素原纯品配制降钙素原校准品；

（5）分装上述降钙素原校准品、碱性磷酸酶标记的降钙素原的单克隆抗体、生物素化抗体和化学发光底物；

（6）组装为成品。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述用碱性磷酸酶标记的降钙素原的单克隆抗体包括以下过程：

（1）将100μL碱性磷酸酶加入到300μL0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液;

（2）加入40μL 25%的戊二醛，混匀，2～8℃活化16小时；

（3) 反应液移至截留分子量8000～12000的透析袋中，在0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液中透析24小时，中间换液2次；

（4）取降钙素原的单克隆抗体适量，用0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液配成4mg/mL的溶液；

（5）取步骤4中溶液125μL加入到步骤3中的透析袋中，2～8℃反应24小时；

（6）溶液转移到玻璃瓶中，加入等体积的甘油，‑15℃保存备用。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述以生物素标记降钙素原的单克隆抗体包括以下过程：

（1）取降钙素原的单克隆抗体1mg，加入0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液，配成4mg/mL的溶液；

（2）将溶液移至截留分子量8000～12000的透析袋中，在0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液中透析24小时；

（3）转移到玻璃瓶中，按照降钙素原单克隆抗体：生物素为1:15的比例加入生物素，室温反应1小时；

（4）移至截留分子量8000～12000的透析袋中，在0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液中透析24小时，中间换两次溶液；

（5）转移到玻璃瓶中，加入等体积的甘油，‑15℃保存备用。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述链霉亲和素包被载体包括以下过程：

（1）100mL 0.05M 2‑吗啉乙磺酸溶液，依次加入 10 mg 磁性微粒和3 mg链酶亲和素；

（2） 然后加入10mg/mL 碳二亚盐酸盐溶液4μL ，反应2小时，在磁场作用下移去上清液；

（3）加入0.01M pH 7.4的磷酸盐缓冲液 10 mL，混匀，移去上清液；

（4）使用0.01M pH 7.4的磷酸盐缓冲液重复洗涤3次，稀释至0.75mg/mL。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述以降钙素原纯品配制降钙素原校准品包括：用降钙素原纯品配制，用重量比2%牛血清蛋白,0.02M pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释，分装为0.5mL/瓶，浓度为 0、0.2、0.5、2、5、20ng/mL，共6瓶，2～8℃保存。