[发明专利]一种从Bt发酵液中分离纯化双效菌素的方法

摘要

本发明公开了一种从Bt发酵液中分离纯化双效菌素的方法，该方法包括8步分离纯化：(1)Al2O3去絮凝沉淀物；(2)无水乙醇去醇不溶性沉淀物；(3)中等极性大孔树脂对双效菌素吸附；(4)无水乙醇萃取，加水浓缩去乙醇，冷冻干燥；(5)非极性大孔树脂对弱极性杂质吸附；(6)使用Agilent Zorbas SB‑C18PerpHT(21.2×250mm；7μm)高效液相色谱柱半制备；(7)使用Agela Venusil ASB‑C18(10×250mm；5μm)高效液相色谱柱半制备；(8)使用Agela Venusil Hilci(4.6×250mm；3μm)高效液相色谱柱半制备，双效菌素纯度在80％以上。

主权项

1.一种从Bt发酵液中分离纯化双效菌素的方法，其特征在于所述方法由四个阶段八个串联步骤组成，这八个步骤有先后次序，且缺一不可；包括(1)Al2O3去絮凝沉淀物；(2)无水乙醇去醇不溶性沉淀物；(3)中等极性大孔树脂对双效菌素吸附；(4)无水乙醇萃取，加水浓缩去乙醇，冷冻干燥；(5)非极性大孔树脂对弱极性杂质吸附；(6)使用Agilent Zorbas SB‑C18 PerpHT(21.2×250mm；7μm)高效液相色谱柱半制备；(7)使用Agela Venusil ASB‑C18(10×250mm；5μm)高效液相色谱柱半制备；(8)使用Agela Venusil Hilci(4.6×250mm；3μm)高效液相色谱柱半制备，双效菌素纯度在80％以上；具体步骤为：(一)去除苏云金芽胞杆菌Bt发酵液中的杂质：(1)去除絮凝沉淀物；取10L初始发酵液，按照1％的浓度加入Al2O3，充分搅拌后置于4℃冰箱静止12小时，取出后，8000r/min离心10min，收集上清，用1mol/L的HCl调至pH4.0，50℃真空浓缩，真空度范围为‑0.095至‑0.088Mpa，浓缩至200mL备用；(2)去除醇不溶性沉淀物；取步骤(1)所制得的备用液体200ml，加入600mL无水乙醇，静置1小时后再次离心，8000r/min离心10min，取上清，即得抗生素粗提液，保存于4℃冰箱备用；(二)样品的粗制：(3)取中等极性大孔树脂，按树脂重量与步骤(2)的粗提液体积1:4的比例混合上样，湿法装柱，装入量的高度100cm，室温静态吸附4‑6小时，先用去离子水洗脱4‑6BV，再用75％乙醇溶液洗脱6BV，1BV为1倍柱体积，双效菌素在乙醇洗脱液中，洗脱流速约3mL/min，收集洗脱液，减压浓缩后用去离子水定容至原体积，这个液体为粗制液体；(三)样品的精制：(4)取步骤(3)所制得的粗制液体200ml，使用冷冻干燥机，将样品冻干，多次加入400ml无水乙醇萃取，取上清液使用0.45μm有机系滤膜过滤后，加水并减压蒸馏除去乙醇，体积浓缩至50ml，再次使用冻干机冻干样品；(5)取非极性大孔树脂，按树脂重量与步骤(4)的粗制冻干样品重量比例1:3混合上样，湿法装柱，装入量的高度60cm，室温静态吸附2‑3小时，用去离子水洗脱4‑6BV，1BV为1倍柱体积，双效菌素存在于水洗脱液中，洗脱流速约1mL/min，收集洗脱液，减压浓缩后用去离子水定容至原体积，得到精制品；(四)高效液相半制备双效菌素：(6)第一次半制备；使用Agilent Zorbas SB‑C18PerpHT(21.2×250mm；7μm)色谱柱，流动相为甲醇、超纯水，柱温40℃，紫外波长为210nm，流速为5ml/min；步骤(5)的精制品上样量为单次0.2ml；洗脱方法为：0‑10min：甲醇:超纯水＝5:95梯度变为甲醇：超纯水＝15：85；10‑15min：甲醇:超纯水＝15:85梯度变为甲醇:超纯水＝20:80；15‑20min：甲醇:超纯水＝20：80梯度变为甲醇:超纯水＝25:75；20‑25min：甲醇:超纯水＝25:75梯度变为甲醇:超纯水＝80:20；25‑35min：甲醇:超纯水＝80:20；多次收集13.5‑17min组分，减压蒸馏除去甲醇，样品冷藏备用；(7)第二次半制备；使用Agela Venusil ASB‑C18(10×250mm；5μm)色谱柱，流动相为甲醇、千分之二甲酸水，柱温40℃，紫外波长为210nm，流速为3ml/min，步骤(6)的精制品上样量为单次0.1ml；洗脱方法为:0‑10min：甲醇:甲酸水＝5:95；多次收集6.3‑6.8min时间段组分，减压蒸馏除去甲醇和甲酸，样品冷藏备用；(8)第三次半制备；Agela Venusil Hilci(4.6×250mm；3μm)，流动相为乙腈、甲醇、千分之一甲酸水，柱温40℃，紫外波长210nm，流速为1ml/min，步骤(7)的精制品上样量为单次0.1ml；洗脱方法为：0‑5min：乙腈:甲醇:甲酸水＝50:50:0；5‑6min：乙腈:甲醇:甲酸水＝50:50:0梯度变为乙腈:甲醇:甲酸水＝40:50:10；6‑14min：乙腈:甲醇:甲酸水＝40:50:10；14‑16min：乙腈:甲醇:甲酸水＝40:40:10梯度变为40:40:20；16‑20min：乙腈:甲醇:甲酸水＝40:20:40；20‑25min：乙腈:甲醇:甲酸水＝40:20:40梯度变为乙腈:甲醇:甲酸水＝40:0:60；25‑40min：乙腈:甲醇:甲酸水＝40:0:60；多次收集14‑15min时间段组分，减压蒸馏除去甲醇、甲酸和乙腈，即得到高纯度双效菌素：依据上述方法即可将双效菌素从Bt发酵液中分离纯化出来，且纯度较高。