[发明专利]黄曲霉毒素B1和B2适配体亲和柱及其制备方法与应用

摘要

本发明提供一种黄曲霉毒素B1和B2适配体亲和柱及其制备方法，该亲和柱以溴化氰修饰的琼脂糖为载体，然后将能够高亲和力、高特异性识别黄曲霉毒素B1和B2的核酸适配体与载体进行共价偶联，偶联后的黄曲霉毒素B1和B2适配体复合载体装填亲和柱。该亲和柱主要用于对于食品、饲料、牛奶、血样以及中药等其他多种样本中黄曲霉毒素B1及B2的纯化及净化，以利于后期对样本中黄曲霉毒素B1和B2的高效液相色谱和荧光检测。

主权项

1.黄曲霉毒素B₁和B₂适配体特异性DNA，其特征在于，核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述黄曲霉毒素B₂适配体特异性DNA在制备黄曲霉毒素B₁和B₂适配体亲和柱中的应用。

3.黄曲霉毒素B₁和B₂适配体亲和柱，其特征在于，所述亲和柱的填料是以溴化氰修饰的琼脂糖为载体，然后将权利要求1所述黄曲霉毒素B₁和B₂适配体特异性DNA与载体进行共价偶联得到的。

4.根据权利要求3所述的亲和柱，其特征在于，所述黄曲霉毒素B₁和B₂适配体特异性DNA是经过化学修饰的适配体序列，修饰方式包括氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰或生物素修饰。

5.根据权利要求4所述的亲和柱，其特征在于，所述黄曲霉毒素B₁和B₂适配体特异性DNA是经过氨基修饰的适配体序列，修饰方法如下：在核酸适配体的3’或5’端通过共价键连接C7间接臂‑(CH₂)₇‑或C6间接臂‑(CH₂)₆‑，然后在C7间接臂或C6间接臂的末端通过共价键修饰氨基，从而得到氨基修饰的适配体。

6.权利要求5所述亲和柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)溴化氰修饰的琼脂糖的制备：将琼脂糖与等体积水混合，并加入配备有pH电极和磁力搅拌器的反应器中，按每mL琼脂糖溶液50～300mg溴化氰的量向上述琼脂糖溶液中加入溴化氰，用NaOH调pH值至11±0.1，整个反应pH值控制在11±0.1，温度控制在20℃±5℃，反应在3～l2min完成；反应结束后，将等体积冰屑迅速加入到上述反应液中，并迅速倾入布氏漏斗，用琼脂糖溶液体积10～15倍量的冷缓冲液抽滤洗涤，其表面的羟基与溴化氰反应，即得到溴化氰修饰的琼脂糖；

2)载体的溶胀和洗涤：以溴化氰修饰的琼脂糖为载体，将30‑100mg载体粉末用1mM盐酸1‑5mL浸泡0.5‑1小时进行溶胀；溶胀后的载体用1mM盐酸洗涤3‑6次，每次盐酸用量1‑5mL，然后用蒸馏水洗涤2‑5次，每次蒸馏水用量1‑5mL，最后用Na₂HPO₄缓冲液洗涤2‑5次，每次缓冲液用量1‑5mL；

3)适配体复性：取1‑5OD的3’或5’端氨基修饰的黄曲霉毒素B₂适配体特异性DNA溶解于Na₂HPO₄缓冲液200‑1000μL中，于75‑95℃复性3‑5min，然后室温放置15‑60min；

4)偶联：向步骤2)洗涤后的载体中加入步骤3)复性好的适配体溶液200‑1000μL，，于20‑35℃摇床震荡过夜；

5)封闭：步骤4)所得偶联产物依次用200mM pH 8.0的Na₂HPO₄水溶液洗涤2‑5次，每次1‑5mL，然后用0.1M pH 8.0的Tris‑HCl缓冲液洗涤2‑5次，每次1‑5mL，然后加入0.1M pH 8.0的Tris‑HCl溶液2‑5mL，于30℃摇床震摇反应1‑6h，封闭剩余活性位点，得到载体‑适配体偶联胶；

6)洗涤：将上述载体‑适配体偶联胶依次用醋酸缓冲液和Tris‑HCl缓冲液先后交替洗涤3‑5次，每次洗涤醋酸缓冲液或Tris‑HCl缓冲液的用量为1‑5mL，除去未偶联的适配体；洗涤后的偶联胶用1‑5mL结合缓冲液重悬，所得偶联胶悬液准备装柱；其中，所述醋酸缓冲液为0.1M醋酸‑醋酸钠水溶液，其中含有0.5M NaCl，pH 4.0；所述Tris‑HCl缓冲液浓度为0.1M，其中含有0.5M NaCl，pH 8.0；所述结合缓冲液中含有10mM Tris，120mM NaCl，5mM KCl和5mM MgCl₂，pH 7.5；

7)装柱：取容积1‑5mL的固相萃取柱，垫好下筛板，用上述偶联胶悬液装柱，至胶高度为1cm，加入0.05w/v％NaN₃溶液0.5‑3mL，于4℃保存；

其中，步骤1)所述缓冲液以及步骤2)‑4)所述Na₂HPO₄缓冲液为200mM Na₂HPO₄+5mM MgCl₂，pH 8.0。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤7)所述固相萃取柱及下筛板的材质为聚丙烯、聚苯乙烯、多孔聚苯乙烯或交联多孔聚苯乙烯；优选地，下筛板的孔径为10μm。

8.权利要求3或4所述亲和柱在富集和纯化样品中黄曲霉毒素B₁和B₂中的应用。

9.权利要求3或4所述亲和柱在净化样品中黄曲霉毒素B₁和B₂中的应用。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述样品选自粮食、饲料、牛奶及乳制品、水产、血液、尿液、水和中药。